新生小鼠缺氧缺血性腦病腦組織caspase-3表達的變化

肖愛嬌，康明非，汪建民，羅小泉

新生小鼠缺氧缺血性腦病腦組織caspase-3表達的變化

肖愛嬌1，康明非2，汪建民3，羅小泉4

目的觀察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3在新生兒缺氧缺血性腦病（NHIE）小鼠模型腦組織中表達的變化。方法選取7 d CD1新生小鼠30只，按隨機數字表法分為假手術組（9只）和NHIE模型組（21只），后者制備NHIE動物模型。用TTC染色法檢查2組的腦組織梗死面積；DAPI染色觀察腦組織病理變化；原位末端標記技術檢測腦組織細胞凋亡；熒光免疫組化法檢測腦組織中caspase-3表達水平。結果假手術組小鼠腦組織未見梗死灶，腦組織細胞排列致密整齊，TUNEL陽性細胞數［（18.57±4.98）個］和caspase-3陽性細胞數［（9.17±2.14）個］明顯低于NHIE模型組的TUNEL陽性細胞數［（209.57±41.27）個］和caspase-3陽性細胞數［（63.33±16.22）個］；與假手術組相比，NHIE模型組小鼠的右側半球可見梗死灶，腦組織細胞大量壞死脫落、周圍組織間隙變大。結論NHIE模型鼠出現的腦組織損傷可能與caspase-3表達增加、腦組織細胞凋亡增加有關。

缺氧缺血；腦梗死；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；小鼠；缺氧缺血性腦病

新生兒缺氧缺血性腦病（neonatal hypoxic-isch?emic encephalopathy,NHIE）指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導致的胎兒或新生兒腦損傷［1］，是新生兒窒息后的嚴重并發癥，較為常見，病情重且病死率高；并可產生永久性神經功能障礙，如智力低下、癲癇、腦性癱瘓、痙攣和共濟失調等，嚴重影響患兒的生活質量，給社會和家庭造成沉重的負擔。研究報道細胞凋亡參與了缺氧缺血性腦損傷的發病過程［2-3］。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3是細胞凋亡的主要執行者，研究發現，NHIE模型鼠腦組織中caspase-3活性增加［4-5］，而NHIE模型鼠腦組織中caspase-3表達量是否增

加尚不清楚。本研究通過建立NHIE小鼠模型，觀察腦組織損傷程度、細胞凋亡及caspase-3表達情況，為下一步研究藥物的作用機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料出生7 d的CD1新生小鼠30只，雌雄不拘，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。TTC試劑（2,3,5-氯化三苯基四氮唑，Sigma）；凋亡原位檢測試劑盒（S7165，Mil?lipore）；兔抗小鼠caspase-3（#9664,Cell Signaling Technolo?gy）；山羊抗兔（A11011,Invitrogen）；含DAPI的熒光封片劑（P36931，Invitrogen）。DL-SSJ頭戴式手術顯微鏡（中國DL公司）；Leica熒光顯微鏡及圖像分析軟件（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 NHIE新生鼠模型制備將小鼠按隨機數字表法分為假手術組（9只）和模型組（21只）。模型組參照Rice-Van?nucci［6］和Levine［7］的方法制備NHIE鼠模型：給予異氟烷吸入麻醉，動物在麻醉狀態下行頸部正中切口，分離右側頸總動脈后用電凝法閉合頸總動脈，縫合傷口。術后動物在室溫中恢復和母乳喂養2 h后，進行低氧處理：將動物置于37℃的密閉艙內，通入含5%CO2的N2，調節氧氣濃度為8%，100 min后將動物取出，返回母鼠身邊繼續哺乳喂養。假手術組：只做手術，不閉合頸總動脈，不缺氧處理。

1.2.2 腦組織梗死檢查于造模后1 d，給予動物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦（假手術組6只，模型組18只），以1.5 mm左右間隔自額向枕切成4個冠狀切片，加入1%TTC染液，置于37℃溫箱中染色20 min，用掃描儀進行掃描，Image J軟件測量每張腦片的梗死面積，并計算梗死體積百分比（%）=［健側半球體積–（患側半球體積–梗死體積）］/健側半球體積× 100%［8］。

1.2.3 腦組織形態學觀察于造模后7 d，給予動物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦，數碼相機拍照后切片，厚30 μm，用含DAPI的P36931熒光封片劑封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 腦組織細胞凋亡檢測于造模后3 d，給予動物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦（2組各3只），置于4%多聚甲醛溶液中固定，PBS清洗后進行切片，厚30 μm，置于1%多聚甲醛溶液中備用。隨機抽取腦組織切片，每個標本取3～5片，按原位凋亡檢測試劑盒說明書檢測腦組織細胞凋亡，即PBS液清洗、末端脫氧核糖轉移酶（TdT酶）工作液37℃孵育1 h、反應終止液、PBS液清洗、加入羅丹明標記物，室溫下放置30 min，PBS液清洗后用普通熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。圖中紅色為TUNEL染色陽性細胞，計數每個100倍視野下的TUNEL陽性細胞數。

1.2.5 腦組織caspase-3陽性細胞檢測于造模后3 d，給予動物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，每組取3個標本，置于4%多聚甲醛溶液中固定，然后移至梯度蔗糖溶液中脫水。待組織塊下沉后進行切片，厚30 μm，置于1%多聚甲醛溶液中備用。隨機抽取腦組織切片，每個標本取3～5片，經PBS漂洗、正常血清封閉后加入兔抗小鼠caspase-3一抗（1∶250），4℃孵育過夜，陰性對照不加一抗，用PBS代替。PBS液洗后，加入山羊抗兔二抗（1∶500），室溫下避光孵育1 h。PBS液洗后風干，用含DAPI的熒光封片劑封固，熒光顯微鏡觀察、拍照。細胞中caspase-3蛋白呈現紅色，DAPI呈現藍色。用Image J軟件進行圖像分析，分別計算每張圖片、每100倍視野下的caspase-3陽性細胞數。

1.3 統計學方法用軟件SPSS 13.0進行分析，計量指標用表示，2組比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織梗死觀察假手術組腦組織全部染成紅色，未見梗死灶，見圖1A。模型組左側半球呈紅色；右側半球有白色梗死灶，見圖1B。腦組織梗死體積百分比為（46.56±6.90）%。

Fig.1TTC staining of mice coronal section of brain圖1 小鼠腦組織TTC染色結果

2.2 腦組織形態學觀察

2.2.1 大體觀察假手術組腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰，見圖2A。模型組右側腦組織表面蒼白、出現液化，且腦溝變淺、腦回變寬，見圖2B。

2.2.2 鏡下觀察假手術組小鼠腦組織細胞排列致密、整齊，見圖3A。模型組小鼠患側腦組織大量細胞壞死、脫落，周圍間隙增大，見圖3B。

2.3 腦組織TUNEL陽性細胞數假手術組小鼠右側腦組織TUNEL陽性細胞數明顯低于模型組（P＜0.05），見圖4、表1。

Tab.1Number of TUNEL-positive cells and caspase-3-positive cells in two groups of rats表1 2組小鼠腦組織中TUNEL陽性細胞數和caspase-3陽性細胞數比較

Tab.1Number of TUNEL-positive cells and caspase-3-positive cells in two groups of rats表1 2組小鼠腦組織中TUNEL陽性細胞數和caspase-3陽性細胞數比較

＊P＜0.05

組別假手術組模型組t n33 TUNEL陽性細胞數18.57±4.98 209.57±41.27 18.43＊caspase-3陽性細胞數9.17±2.14 63.33±16.22 8.110＊

2.4 腦組織caspase-3陽性細胞數假手術組小鼠右側腦組織caspase-3陽性細胞數明顯低于模型組（P＜0.05），見圖5、表1。

3 討論

NHIE是由各種因素（如宮內窘迫、臍帶脫垂以及產婦休克等圍產期因素）引起圍產期窒息，進而導致腦的缺氧缺血性損傷［9］。據資料統計，NHIE占新生兒住院病例的18.1%。我國每年出生活產嬰兒1 800萬～2 000萬，窒息發生率為13.6%，因為窒息導致傷殘占窒息患兒的15.6%，每年大約有30萬殘疾兒童產生，嚴重危害了兒童的生活質量［10］。因而對該病的研究引起了廣泛的關注。

許多疾病的研究都得益于成功的動物模型。由Rice［6］和Levine［7］建立的NHIE新生鼠模型是目前使用最多的模型。因此，本研究參照上述方法，采用單側頸總動脈閉塞后再給予缺氧100 min制備NHIE新生小鼠模型，TTC染色和形態學觀察結果顯示：假手術組小鼠腦組織未見梗死灶，腦組織外觀紅潤，組織細胞排列致密、整齊；而模型組小鼠患側半球可見梗死灶，患側腦組織表面蒼白、出現液化，組織細胞大量壞死脫落，周圍間隙擴大。上述結果表明，頸總動脈閉塞后、缺氧100 min可造成腦組織損傷。然而腦組織損傷的病理機制卻是相當復雜。

NHIE的病理機制很多，包括線粒體損傷、氧化應激、炎癥反應、興奮性毒性和細胞凋亡等。其中，細胞凋亡在缺氧缺血性腦損傷中的作用十分重要。本研究觀察到，NHIE新生鼠模型腦組織中TUNEL陽性細胞數增加。表明細胞凋亡參與了新生鼠缺氧缺血性腦損傷的發生。與文獻［2-3,11］研究結果相似。Caspase-3是細胞凋亡的主要執行者，其可通過多個途徑作用于細胞骨架蛋白、DNA修復調節因子、細胞周期調節蛋白等，導致細胞DNA修復功能喪失、caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspases-acti?vated DNase，CAD）激活，導致DNA片段化，失去正常功能而凋亡［12］。據研究報道，NHIE模型鼠腦組織中caspase-3活性增加［4-5,13］。本研究觀察到，NHIE模型小鼠患側腦組織caspase-3陽性細胞數明顯增多。上述研究結果表明，NHIE可能與caspase-3表達增多、導致細胞凋亡增加有關。

（圖3～5見插頁）

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（2015-04-10收稿 2015-06-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Increased expression of caspase-3 in ipsilateral neonatal hypoxic-ischemia encephalopathy model in mice

XIAO Aijiao1,KANG Mingfei2,WANG Jianmin3,LUO Xiaoquan4
1 Department of Physiology，2 Department of Rehabilitation of Affiliated Hospital，3 Department of Anatomy，4 Animal Experiment Center of Science and Technology，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China

ObjectiveTo observe apoptotic cells and caspase-3-positive cells in ipsilateral neonatal hypoxic-isch?emia encephalopathy（NHIE）model in mice.MethodsCD1 mice of age 7 days（n=30）were randomly divided into two groups:sham group（n=9）and model group（n=21）.NHIE model was induced by right common carotid artery ligation fol?lowed by 8%oxygen hypoxia for 100 min.TTC staining was used to determine area of brain infarction.DAPI staining was used to detect pathological change in brains.TUNEL assay was used to detect apoptotic cells and fluorescence immunohisto?chemistry was used to detect caspase-3 expression in the ipsilateral brain.ResultsNo infarct was detected in sham group. Cells were densely and orderly arranged in brain.TUNEL-positive cells（18.57±4.98）and caspase-3-positive cells（9.17± 2.14）in the ipsilateral brain were both less than those in the ipsilateral brain of mice in model group（209.57±41.27）and（63.33±16.22）respectively.Mice in model group presented infarct in the right hemisphere with more dead cells and wider in?terstitial space compared with sham group.ConclusionBrain injury in NHIE model might be related to the increasing cas?pase-3 expression thus leads to apoptosis.

hypoxia-ischemia；cerebral infarction；apoptosis；caspase 3；mice；hypoxic-ischemic encephalopathy

R742

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.008

國家自然科學基金資助項目（81060305）；江西中醫藥大學課題（2014ZR018）；江西省衛生計生委中醫藥科研計劃項目（2014Z003）；江西省自然科學基金資助項目（20151BAB205068）

1江西中醫藥大學生理學學科組（郵編330004），2針灸康復科，3解剖學學科組，4實驗動物科技中心

肖愛嬌（1973），女，副教授，博士，主要從事中醫藥神經保護作用機制研究