小鼠原位氣管移植模型手術技巧及改良

王欣，董明，陳興隆，李光△

小鼠原位氣管移植模型手術技巧及改良

王欣1，董明2，陳興隆3，李光3△

目的探討改良原位氣管移植模型的手術方法以提高生存率，減少手術時間。方法清潔級C57BL/6（供體）和BALB/c（受體）小鼠各30只，依體質量相近配對并隨機分為3組。采用“經口插管氣道內支架”吻合，原位氣管移植建立動物模型，并記錄手術時間。術后觀察實驗動物生存期及一般狀況，并分別于術后15、30及60 d各處死10只，取出氣管，HE染色觀察移植氣管的組織病理變化，計算氣管阻塞率。結果受體小鼠均存活至取氣管時，手術時間：供體氣管摘除（7.0±1.0）min，受體氣管摘除（7.0±1.0）min，經口插入套管（1.0±0.5）min，供體氣管吻合（20.0± 4.0）min，手術總時間（43.0±10.0）min。移植后氣管淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，氣管阻塞率于15、30及60 d逐漸增加，符合閉塞性細支氣管炎病理特點。結論經口插管氣道內支架吻合法建立小鼠原位氣管移植模型操作簡便，手術技巧和設備要求低，手術成功率高。不需要專業的外科技巧及手術設備。

肺移植；細支氣管炎,閉塞性；疾病模型,動物；小鼠,近交C57BL；小鼠,近交BALB C

在肺移植手術的預后中，閉塞性細支氣管炎（obliterative bronchiolitis，OB）的5年和10年發生率可分別在50%和75%左右［1］。閉塞性細支氣管炎的發病機制目前仍不清楚。其研究模型主要有異位和原位氣管移植。相比較于異位氣管移植，原位氣管移植更能模擬出肺通氣與換氣的過程，但操作難度更大，模型的成活率較低［2］。本研究旨在探討原位氣管移植改良方法，以期為肺移植的基礎研究提供模型選擇。

1 資料與方法

1.1 一般資料清潔級C57BL/6和BALB/c雌性小鼠各30

只（天津醫科大學實驗動物中心），體質量25～30 g。C57BL/ 6小鼠作為供體組，BALB/c小鼠作為受體組，2組相近體質量配對成30對后隨機分成3個配對組，每組10只，供、受體均為清潔手術，術前不禁食水，2%水合氯醛腹膜內注射麻醉，縫合采用9-0尼龍縫線（上海精儀醫療器械廠），單人操作。受體組術后燈照保暖3 h，禁食水6 h，分別于術后15、30、60 d處死10只。

1.2 原位氣管移植（1）供體手術。水合氯醛0.1 mg/g腹膜腔注射麻醉，仰臥位，固定于手術臺。取小鼠的頸前正中切口。游離氣管，截取出4～6個軟骨環長度氣管，見圖1A。在尾端12點位置用9-0帶針縫合絲穿過，用以標記方向和提拉氣管。將取出的氣管置于4℃的生理鹽水中沖洗存放。修剪供體氣管，去除周圍組織，保留至少4個氣管軟骨環長度氣管備用。（2）受體手術。麻醉固定后，22G套管應用Das法［3］經口插入受體小鼠氣管,解剖游離受體氣管,見圖1B。取環狀軟骨下第6個氣管環處切開氣管，但不切斷，延切口處伸出22G氣管內套管，插入供體氣管，并用供體氣管尾部預留9-0縫線與受體尾端氣管12點處縫合不打結。完全切斷氣管，將氣管內套管插入供體氣管及受體下端氣管，移植氣管12點縫合處對位打結。于尾端吻合口4點、8點處縫合打結。同時按上述方法吻合頭側氣管。縫合肌肉及皮膚。經氣管內套管負壓吸引，清理氣管，拔出套管。

Fig.1Orotracheal intubation圖1 經口氣管插管

1.3 手術時間及存活情況記錄以下各個階段完成時間：（1）供體氣管摘除時間。（2）受體氣管分離時間。（3）經口插入套管時間。（4）供體氣管吻合時間。（5）手術總時間。觀察實驗動物術后生存期的體質量和呼吸音變化。

1.4 病理學特征受體小鼠分別在第15、30、60天時處死10只，常規解剖取出氣管，觀察移植氣管局部解剖特征。常規石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后光鏡（×100）下觀察。

1.5 氣管阻塞率測定在移植氣管的中段平均取5個斷面，每個斷面估算阻塞的百分率，阻塞百分率=阻塞面積r2/氣管面積R2（r、R分別為阻塞和氣管的半徑），取5個斷面阻塞百分率的平均值作為該氣管的阻塞率。

2 結果

2.1 手術時間及存活情況手術操作過程中無小鼠死亡，術后小鼠模型的存活率100%，手術操作時間：供體氣管平均摘除時間為（7.0±1.0）min，受體氣管平均分離時間（7.0±1.0）min，經口插入套管平均（1.0±0.5）min,供體氣管吻合平均（20.0±4.0）min，手術總時間平均（43.0±10.0）min。受體小鼠術后出現呼吸急促，哮鳴音，8～9 d后略有緩解。但至預殺期癥狀持續存在。術后第15、30、60天存活小鼠體質量為（28.0±2.0）g，無明顯變化。

2.2 病理學特征處死小鼠后，可見周圍覆被的肌肉組織同移植氣管緊密相連，有血管長入移植氣管。移植后15 d鏡下可見氣管上皮較完整，黏膜下層淋巴細胞浸潤較少，軟骨形態較完整，少量壞死；30 d可見移植氣管上皮脫落壞死，少許鱗狀上皮覆蓋吻合口，黏膜下大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，軟骨細胞壞死；60 d可見移植氣管上皮大量脫落壞死，鱗狀上皮覆蓋吻合口，黏膜下大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，氣管管腔嚴重阻塞，軟骨細胞壞死，部分軟骨中間部正常結構不能分辨，見圖2。

Fig.2Histological features of allografts on D 15,30 and 60 after transplantation（HE，×100）圖2 各時點移植氣管光鏡下病理情況觀察（HE，×100）

2.3 氣管阻塞率移植氣管管腔逐漸閉塞。移植后15、30及60 d的氣管阻塞率分別為（26.4± 3.7）%、（39.6±4.1）%及（45.3±3.2）%。

3 討論

在早期研究閉塞性細支氣管炎時，曾采用異位氣管移植的方法，但此法移植氣管無通氣換氣功能，

不符合人體肺移植后氣管的生理需求［4］。原位氣管移植模型可解決此問題，可以模擬出人體在肺移植后發生閉塞性細支氣管炎的癥狀。但是小鼠原位氣管移植模型由于實驗動物體型較小，需要較高的手術操作技巧以及精密的手術儀器，建模有一定困難；而大型動物原位氣管移植操作雖然簡單，但是成本較高［5］。

Genden等［6］2002年首次建立小鼠的原位氣管移植模型，但模型建立過程需要手術顯微鏡，對器械及手術熟練度要求也較高。本研究組前期應用Genden法建立動物模型，死亡率較高，考慮死亡主要原因:一是在氣管吻合過程中，周圍組織滲出液誤吸入氣道，導致窒息；其次，由于移植氣管吻合對位不良，易導致氣道扭轉移位造成實驗動物死亡。本研究對其手術方法進行了改良，應用氣管內插入套管保證氣道通暢，便于清理氣道，防止誤吸；同時形成骨性支架，方便吻合，先于供體氣管和受體氣管。在尾端12點縫合定位，以防止吻合后對位不良，氣道扭轉。同時，此法手術時間短，平均為（43.0±10.0）min，術后小鼠均存活至預殺期，有較高手術存活率，可以為下一步實驗提供良好的模型保障。

臨床上的閉塞性細支氣管炎模型主要表現為細支氣管黏膜周圍有大量的中性粒細胞以及淋巴細胞浸潤，管腔內有肉芽組織增生導致的狹窄阻塞［7］。本研究病理觀察顯示，隨著時間推移，移植氣管上皮逐漸脫落壞死，鱗狀上皮覆蓋吻合口，黏膜下淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，氣管管腔阻塞，氣管阻塞率逐漸增加，符合閉塞性細支氣管炎病理學特點。同時，與異位氣管移植模型比較，此種移植方式使移植氣管具備通氣功能，更加符合生理特點［8］。移植氣管的血液供應是氣管存活的重要條件，以往人們采用大網膜包繞、肌瓣包繞等［9］方法解決移植后氣管的血供問題。本研究在移植后直接用頸部肌肉和腺體包繞氣管，移植后氣管大量鱗狀上皮覆蓋吻合口，氣管內炎性細胞浸潤，移植后小鼠均存活至預殺期，表明移植氣管存活良好。小鼠解剖過程中可見周圍覆被的肌肉組織同移植氣管緊密相連，有血管長入移植氣管，考慮可能與小鼠自身再生能力較強有關。

綜上所述，本研究新建的氣管移植模型，不需要使用手術顯微鏡和微創外科器材等特殊昂貴的手術器材，術者也無需進行專業的手術操作訓練，手術操作時間短，可獲得較高的模型存活率，為下步實驗提供穩定的模型保障。同時，實驗動物保存了通暢的氣管，與人體肺移植后氣管生理功能相符，移植術后產生與閉塞性細支氣管炎相似的病理改變，實驗動物均可長期存活，為后續的研究提供了保證，具有一定的實用價值。

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（2015-02-12收稿 2015-03-31修回）

（本文編輯 陸榮展）

Technique improvement in establishing mice orthotopic tracheal transplantation surgery model

WANG Xin1，DONG Ming2，CHEN Xinglong3，LI Guang3△
1 Department of Pediatric Surgery，Tianjin Children′s Hospital，Tianjin 300134，China；2 Department of Lung Cancer Surgery，Tianjin Medical University General Hospital；3 Basic Medical College，Tianjin Medical University△

ObjectiveTo explore a simple and effective way of establishing a mice orthotopic tracheal transplantation model in studying bronchiolitis obliterans to reduce operation time.MethodsTracheas from C57BL/6 mice（n=30）were im?planted into Balb/c mice（n=30）.Grafts and hosts were matched according to body weight."Orotracheal intubation and endostent"was used for trachea anastomose and animal model was establish.Operating time was also noted.Grafts were harvest?ed on Days 15,30 and 60 after transplantation,using HE staining to observe pathological changes of allograft.Trachea block?ing rate was also calculated.ResultsUntil survival of trachea transplantation,the operative time of donor′s and the recipi?ent′tracheas resection were（7.0±1.0）min and（7.0±1.0）min respectively."Orotracheal intubation the endo-stent"establish?ment cost（1±0.5）min.Trachea anastomose took（20.0±4.0）min and the operation time last（43.0±10.0）min.Conclusion The improvement of orthotopic tracheas transplantation using"Orotracheal intubation the endo-sten"for trachea anastomose is esay-operated and did required complicate skills and instruments with high successful rate.So it is an ideal and stable model in studying bronchiolitis obliterans.

lung transplantation；bronchiolitis obliterans；disease models,animal；mice,inbred C57BL；mice,inbred BALB/C

R655.3；R617

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.010

國家“863”高技術研究發展計劃資助項目（2012AA021003）；天津市衛生局科技基金資助項目（2014KZ127）

1天津市兒童醫院兒外科（郵編300134）；2天津醫科大學總醫院肺部腫瘤外科；3天津醫科大學基礎醫學院

王欣（1983），女，主治醫師，碩士，主要從事小兒外科及相關基礎研究

△通訊作者E-mail：lgtijmu@163.com