穿心蓮內酯對小鼠肝細胞色素P450的影響

胡 穎蘇 健

（1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學廣西中醫藥科學實驗中心，廣西 南寧 530200）

穿心蓮內酯對小鼠肝細胞色素P450的影響

胡 穎1蘇 健2

（1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學廣西中醫藥科學實驗中心，廣西 南寧 530200）

目的：研究穿心蓮內酯對小鼠肝細胞色素P450的影響。方法：小鼠給藥穿心蓮內酯或3-甲基膽蒽后，分別測量小鼠肝臟內P450酶的總含量、CYP1A1/2的活性和蛋白表達等指標。結果：穿心蓮單獨給藥時，對CYP1A1/2的活性及蛋白表達沒有影響。穿心蓮內酯和3-甲基膽蒽聯合給藥時對CYP1A1/2的活性呈誘導作用，同時CYP1A1/2的蛋白表達均顯著高于空白對照。結論：穿心蓮內酯與3-甲基膽蒽聯合用藥時對小鼠肝P450的活性及蛋白表達均顯示出一定的調控作用。

穿心蓮內酯；細胞色素P450；CYP1A；活性；蛋白表達

細胞色素P450（CYP450）是一類含血紅素的單鏈蛋白質，是哺乳動物肝臟代謝外源物的主要酶系。根據氨基酸序列相似性，CYP450被分為CYP1、2、3家族及A、B、C等亞族[1, 2]。CYP450通過加氧反應參與外來化合物的代謝，將一些毒性物質代謝失活后排出體外，從而產生保護作用；另外一些外來化合物則可能被激活而產生藥理活性或毒性[3]。許多外來化合物在被 CYP450代謝的同時反過來也會影響 CYP450的活性，如：3-甲基膽蒽（3-methylcholanthrene，3MC）對CYP450有誘導作用，而一些烷基化試劑則對其有抑制作用[4]。CYP450活性的變化直接影響各種藥物在體內的代謝過程，到目前為止的研究中，參與藥物代謝的 CYP450主要有 CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1等，它們所針對的藥物類型各有不同，其中CYP1A亞族在對外來化合物的代謝中起著非常重要的作用，CYP1A2占肝臟總CYP450氧化酶含量的 13%，參與許多如黃嘌呤類，抗抑郁藥，抗炎鎮痛藥，抗精神病藥等藥物的代謝[3]。CYP450酶活性的變化將導致相應藥物的血藥濃度，生物利用度，半衰期等代謝指標的變化[3，5]，因此，研究CYP450的活性以及藥物對其的影響是用藥實踐中很重要的組成部分。

中藥的代謝研究是中藥現代化研究的重要組成部分，隨著中藥在臨床上的廣泛應用和研究的不斷深入，中藥的代謝相關研究報道越來越多，黃芩[6]、葛根[7]、銀杏[8]、水飛薊[9]、吳茱萸[10]、人參[11]等數十種中藥中的化學成分對 CYP450調控作用相繼被研究和報導，為臨床安全、有效、合理的使用中藥提供了科學依據。穿心蓮（Andrographispaniculata (Burm. f.) Nees）是一味常用中藥，具有清熱解毒，涼血，消腫的功效；用于治療感冒發熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫瘡瘍，毒蛇咬傷等病癥[12]。穿心蓮內酯（Andrographolide, AG）是穿心蓮的主要有效成份，現代藥理學研究證明，穿心蓮內酯具有抗炎[13]、抗病毒[14]、抗癌[15]、免疫活性[16]和保肝護肝[17]等作用。但是有關穿心蓮內酯對CYP450活性影響的體內研究仍未見報道。本文通過測量小鼠肝內 CYP450的總含量、酶活性及蛋白表達來研究穿心蓮內酯對代謝酶 CYP450的影響。研究的結果對穿心蓮的臨床使用和新藥研發具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 動物

約8周大的雄性ICR小鼠，體重20-25g，由泰國孔敬大學醫學院動物實驗中心提供，飼養在有木屑墊底的塑料鼠籠里，飲食與水充足供應，飼養環境溫度控制在20-23℃，室內的光照設定為12小時明亮，12小時黑暗的循環。

1.2 試劑

穿心蓮內酯購自日本大阪 Wako?公司（純度≥99%）；3-甲基膽蒽購自美國賓夕法尼亞SUPELCO公司（純度≥99%）；一氧化碳購自德國Messer GmbH公司（純度≥99.99%)）；還原型輔酶 II、甲氧基試鹵靈、乙氧基試鹵靈等購自美國圣路易斯Sigma Chemical公司；兔抗鼠CYP1A1/2蛋白多克隆抗體由日本富山大學提供；免疫蛋白質印跡法醋酸纖維膜購自美國Bio-Rad公司。

1.3 分組及給藥

小鼠被隨機分為8組（n=3），為別為：①空白組（NT），皮下注射橄欖油 1天；②對照組（3MC），皮下注射 3MC （50mg/kg體重）1天；③穿心蓮內酯1天組（AG:1d），皮下注射AG（5mg/kg 體重）1天；④穿心蓮內酯3天組（AG:3d），皮下注射 AG（5mg/kg 體重）3天；⑤穿心蓮內酯 5天組（AG:5d），皮下注射AG（5mg/kg 體重）5天；⑥聯合給藥1天組（3MC+AG:1d），分別皮下注射3MC（50mg/kg體重）和AG（5mg/kg 體重）1天；⑦聯合給藥3天組（3MC+AG:3d），分別皮下注射3MC（50mg/kg體重）和AG（5mg/kg 體重）3天；⑧聯合給藥5天組（3MC+AG:5d），分別皮下注射3MC （50mg/kg體重）和AG（5mg/kg 體重）5天。各組小鼠在完成給藥24小時后被斷頭處死，通過門靜脈灌注清除小鼠肝臟內的血液，切下部分肝組織，稱重備用。

1.4 小鼠肝微粒體的提取及蛋白含量的測定

取小鼠肝組織，在1.15% KCl中勻漿，10,000g（4°C）離心5分鐘。上層液繼續用超高速冷凍離心機在104,000g（4°C）的條件下離心60分鐘，收集沉淀得到微粒體顆粒，用冰蒸餾水稀釋后即為微粒體懸浮夜[18]。用Bradford測定蛋白質的方法，以牛血清白蛋白作為蛋白質標準品，測定微粒體懸浮液的蛋白質含量[19]。

1.5 CYP450的含量測定

小鼠肝微粒體中 CYP450的總含量測定采用一氧化碳還原差示光譜法測定[20]。吸取上述微粒體懸浮液，用含22.22%甘油的0.22M Tris緩沖鹽溶液稀釋10倍，加入10%的連二硫酸鈉，搖勻后通入一氧化碳60秒，然后用紫外分光光度計由420nm向500nm掃描，通過比較450nm和490nm波長下的吸收度值來計算CYP450的含量。計算公式如下：

1.6 CYP1A1和CYP1A2的活性測量

CYP1A1和 CYP1A2分別為乙基試鹵靈-O-脫甲基反應（Methoxyresorufin O-demethylation，MROD）和甲基試鹵靈-O-脫甲基反應（Ethoxyresorufin O-deethylation, EROD）的特異性催化酶，在對甲/乙基試鹵靈的脫羥基化后，用熒光定量法測量催化產物試鹵靈的含量，進而確定 CYP450的活性[18,21]。本反應溶液中含10mg/ml的肝微粒體，0.1M Tris緩沖液（pH7.8），10mM的甲/乙基試鹵靈，10mM的NADPH。熒光激發和吸收波長分別為585nm和530nm。

1.7 蛋白質印記法測量CYP1A1和CYP1A2的表達

首先將肝微粒體蛋白在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后將蛋白轉移到硝酸纖維膜上。用兔抗鼠CYP1A1/2蛋白多克隆抗體定位CYP450中對應蛋白，加入羊抗兔免疫球蛋白和生物素化辣根 H-抗生物素蛋白復合物，最后通過3,3'-二氨基聯苯胺和過氧化氫進行顯色[18]。

1.8 數據分析和統計

將各組的數據計算平均值和標準差。用T檢驗、單因素方差方析法和組間多重比較分析法，分別在顯著性水平小于0.05和0.01下考查組間的差異。

2 結果

2.1 CYP450 的總含量

給藥后各組的CYP450含量如圖1所示。與對照組相比，3MC單獨給藥組、3MC和穿心蓮內酯聯合給藥1天、3天組的 CYP450含量出現了下降。但各組間沒有產生具有統計意義的顯著性差異。

圖1 穿心蓮內酯和3MC對小鼠肝P450總含量的影響

2.2 CYP1A1和CYP1A2的活性

結果如圖2、3所示。相比空白對照組，誘導劑3MC分別使EROD和MROD的催化活性增加了3.6倍和2.01倍。單獨給藥穿心蓮內酯時對EROD和MROD的影響都不明顯，只有第5天時對EROD催化活性被發現有顯著性增加（P＜ 0.01）。在3MC和穿心蓮內酯聯合給藥的情況下，對EROD的催化活性從第1天的21.99 下降至第5天的13.51 pmol/min/mg蛋白，接近空白對照組的水平（10.38），提示了 CYP1A1活力受到抑制；另一方面，聯合給藥使對MROD的催化活性從第1天的15.99上升至第5天的40.66pmol/min/mg 蛋白，提示了聯合給藥對CYP1A2的誘導作用。

圖2 穿心蓮內酯和3MC對小鼠肝中EROD催化活性的影響

圖3 穿心蓮內酯和3MC對小鼠肝MROD催化活性的影響

2.3 CYP1A1和CYP1A2的蛋白表達

免疫蛋白質印跡法的實驗結果如圖4所示。AG給藥組中，CYP1A1和CYP1A2的蛋白表達接近空白對照組的水平，3MC稍高于空白對照組的水平。3MC與穿心蓮內酯聯合給藥后，CYP1A1和CYP1A2的蛋白表達水平顯著增加，且表達水平不隨給藥時間延長而變化。

圖4 穿心蓮內酯和3MC對小鼠肝CYP1A1和CYP1A2蛋白表達的影響

3 討論

外來化合物在體內被 CYP450催化代謝，同時也反過來影響CYP450的活性。當CYP450被外來化合物誘導時，其活性增強，專屬底物代謝加快，在臨床用藥時，可能會引起部分藥物的血藥濃度、半衰期和生物利用度下降，影響藥效。如果外來化合物對 CYP450酶產生了抑制作用，酶活力下降甚至不能進行代謝反應，則其專屬底物的代謝減慢，在體內積累無法排出，一些原本在低濃度時無毒的化合物就會產生毒性，藥物出現毒副作用或者毒副作用增強。

穿心蓮是一味常用的中藥材，具有清熱解毒，涼血，消腫的功效。臨床上多與大青葉、麥門冬、白茅根、金銀花、六月雪、黃梔子等藥材同用[22]。隨著中醫與西醫不斷交流與融合，中藥與西藥在聯合使用的情況日益增加，合理的配伍能提高療效，縮短療程；但聯合用藥的過程中也會出現藥物間的不良反應[23]。已有報導顯示穿心蓮類制劑與一些常用的西藥出現了配伍禁忌，但未涉及體內過程的機理[24]。本實驗研究部分揭示了穿心蓮在體內代謝過程中與代謝酶的相互影響的機制，為穿心蓮的與其它藥物在聯合使用時提供有意義的參考。

在本實驗結果中，穿心蓮內酯及3MC對CYP450總含量的影響差異不大，但對具體的亞族活性的影響則各有不同。單獨給予穿心蓮內酯到第5天時，CYP1A1的活性出現了上升，提示該誘導作用與給藥時間有關。穿心蓮內酯在聯合CYP450誘導劑（3MC）給藥時，CYP1A1/2亞族都出現了誘導反應。不同的是，CYP1A1活性呈逐漸下降的趨勢，而CYP1A2的活性則隨時間的增加顯著上升，這一點應該值得注意。該結果提示了在有芳烴氧化物等親電活性物質（如3MC）的情況下，穿心蓮及其制劑將導致 CYP1A1/2的催化底物代謝加快，出現有效成分失活加速或者代謝產品毒性積累上升的情況。

本實驗結果中一個比較有趣的現象是，CYP1A1的蛋白表達與其活性不成對應關系，例如聯合給藥誘導CYP1A1的蛋白表達增加，但其活性卻出現了下降。可能的原因是該酶在其數量增加后，在活性的體現前仍然需要一個誘導激活的過程。具體的發生機理有待進一步的實驗證明。

本文在完成過程中得到了泰國孔敬大學副教授Kanokwan Jarukamjorn的悉心指導，在此表示誠摯的感謝！

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Effect of andrographolide on cytochrome P450 in mouse liver

Objective:To study the effect of andrographolide on cytochrome P450 enzymes in mouse liver.Methods: Andrographolide and 3MC were administrated to the animal, followed by measuring the total concentration of P450, the activity and protein expression of CYP1A1/2, respectively. Results:AG alone did not affect the activities and protein expression of CYP1A1/2, the CYP1A1/2 activities were induced after andrographolide and 3MC were administrated together, while the protein expression of CYP1A1/2 were significantly increased. Conclusion:Andrographolide administrated together with 3 MC showed potency to modulate P450s activity and protein expression.

Andrographolide; P450; CYP1A; activity; protein expression

R285

A

1008-1151(2015)05-0096-03

2015-04-11

廣西壯瑤藥重點實驗室（桂科基字[2014]32號）；壯瑤藥協同創新中心（桂教科研[2013]20號）；廣西重點學科（壯藥學）（桂教科研[2013]16號）；“中藥創新理論與藥效研究”八桂學者項目。

胡穎（1979－），女，廣西中醫藥大學藥學院藥理教研室教師，藥師。