基于斑馬魚骨質疏松模型評價一組2-乙酰苯并五元雜環類化合物的抗骨質疏松活性

薛司徒，秦偉，劉宗英，金潔，陳博，李卓榮

基于斑馬魚骨質疏松模型評價一組2-乙酰苯并五元雜環類化合物的抗骨質疏松活性

薛司徒，秦偉，劉宗英，金潔，陳博，李卓榮

目的 采用地塞米松建立斑馬魚骨質疏松模型，篩選先導物G39 及其結構類似物的抗骨質疏松活性。

方法 斑馬魚 AB 系胚胎受精后 6 ～ 72 h 浸于地塞米松溶液建模，受精后 3 d分組給藥直至受精后 6 d，收集固定斑馬魚幼體；采用茜素紅染色法顯示成骨發育狀況，顯微拍照后以 G39 為對照，進行斑馬魚頭面骨成骨面積和骨礦化密度的半定量分析，比較六種 2-乙酰苯并五元雜環類化合物潛在的抗骨質疏松活性。

結果 G39 5 μg/ml 組對地塞米松導致的斑馬魚骨質疏松具有顯著的改善作用，且實驗結果與地塞米松大鼠模型具有一致性。以此篩選 G39 衍生物體內活性，發現苯并呋喃衍生物 410 活性優于 G39。

結論 地塞米松斑馬魚骨質疏松模型評價周期縮短、成本低，使抗骨質疏松藥物體內活性批量篩選成為可能，為更快更準地發現抗骨質疏松候選藥物打下堅實基礎。通過本研究篩選得到了全新結構類型的抗骨質疏松化合物 410，其活性較 G39 更強，值得進一步研究。

抗骨質疏松； 斑馬魚； 2-乙酰苯并五元雜環類化合物； 活性篩選

隨著老齡化社會的到來，骨質疏松（osteoporosis，OP）的發生率逐年上升，據統計已約占人口總數的十分之一［1］，美國和歐洲每年因OP 引起骨折產生的醫療費用高達 230 億美元以上。60 歲以上老年人，骨質疏松發病率男性為35.8%，女性為 73%，接近 40% 的婦女一生中都會發生骨質疏松導致的骨折［2］。在快速進入老齡化社會的中國，老年人的骨健康問題更為突出。健康成人骨骼成熟期骨量不增加也不減少，但仍然存在大量骨重建［3-4］?？构琴|疏松藥物以其作用機制為依據，分為破骨抑制劑類藥物與成骨促進劑類藥物?，F今臨床常用抗骨質疏松藥物為雷洛昔芬與雙膦酸鹽，兩者均為破骨抑制劑類藥物，只能通過減低骨重建速度暫時緩解骨質疏松癥狀，不能糾正每一次重建時發生的不平衡［5-7］。重組人甲狀旁腺素和重組人骨形態發生蛋白 rhBMP-2、rhBMP-7 為成骨促進劑類藥物，均存在價格昂貴、用量大且半衰期短等基因治療的共性問題，兩者作為抗骨質疏松藥物，受眾群體窄。

隨著對骨代謝平衡調節機制及骨質疏松發生機制研究的不斷深入，通過促進骨形成抗骨質疏松的新型小分子藥物研究成為熱點。近年來，活性天然產物通過上調 BMP-2（bone morphogenetic proteins 2）改善大鼠骨質疏松的研究陸續被發表［8-10］。本課題組在以 BMP-2 為靶點的新型促進骨形成抗骨質疏松藥物的研究中，發現化合物1-（苯并［b］噻吩-2-基）乙酮（G39）（圖 1）在體外實驗和快速老化骨質疏松模型小鼠（SAMP6）體內均具有明顯上調 BMP-2 的活性，并且 G39 在去勢大鼠（SAM）以及地塞米松大鼠骨質疏松模型中均顯示出明顯改善骨質疏松癥狀的作用［11-12］。

圖1 實驗化合物的結構Figure 1 The structure of experimental compounds

同時，在前期研究中我們也發現，通常采用的SAMP6 小鼠、SAM 大鼠以及地塞米松大鼠模型體內抗骨質疏松活性研究的實驗周期長、技術復雜、研究成本高，不適于抗骨質疏松活性化合物的早期篩選，已成為制約新型抗骨質疏松藥物研發的技術瓶頸。為克服上述問題，本研究所張靖溥教授組利用地塞米松建立了斑馬魚早期骨質疏松模型，較哺乳動物模型大大縮短實驗周期，顯著提升了研究效率［13-14］，較好彌補了哺乳動物模型作為早期活性篩選研究的不足。

本論文基于前期工作，應用地塞米松斑馬魚骨質疏松模型，對 G39 及其結構類似物（圖 1）進行活性篩選研究，評價不同母核 2-乙酰苯并五元雜環類衍生物抗骨質疏松活性，以期發現新型成藥性更好的抗骨質疏松化合物，推動此類促骨形成抗骨質疏松藥物的研發工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 所有試劑均為市售化學純或分析純，購于北京百靈威公司；實驗化合物為本實驗室合成，純度大于 99%。

1.1.2 實驗動物 斑馬魚（Danio rerio）野生型AB 品系，由清華大學生命科學學院孟安明教授惠贈。

1.1.3 實驗儀器 LRH 系列生化培養箱為上海一恒科學儀器有限公司；顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；MP90 型自動熔點儀為瑞士 Mettler Toledo 公司產品，溫度未校正；Mercury 核磁共振儀為美國Varian 公司產品，內標為 TMS；AutoSpec Ultima-Tof串聯質譜儀為英國 Micromass 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 G39 地塞米松斑馬魚骨質疏松模型活性評價實驗 將受精后 6 h（6 hpf）斑馬魚 AB 系胚胎暴露于 100 μg/ml 地塞米松溶液中，直至 72 hpf；72 hpf 后斑馬魚幼體使用斑馬魚飼養用水洗 2 次以去除地塞米松溶液；將斑馬魚分為 4 組，A 組為模型組，將溶液換為斑馬魚飼養水；B 組為溶劑對照組，將溶液換為 0.1% DMSO；C 組為低劑量 G39 給藥組，將幼體浸于 1 μg/ml 藥物溶液中；D 組為高劑量 G39 給藥組，將幼體浸于 5 μg/ml藥物溶液中；同時設置未經地塞米松處理的野生型斑馬魚對照組 E。觀察各組斑馬魚狀態直至受精后6 d（6 dpf）；收集上述處理的 6 dpf 幼體，用 ddH2O將胚胎清洗 3 遍，4% 多聚甲醛固定 2 h；使用0.01% 茜素紅、25% 甘油、0.1% KOH pH 7.5 染色液染色過夜。分別使用 80% EtOH、100 mmol/L Tris pH 7.5、10 mmol/L MgCl2溶液 10 min；50% EtOH 和 100 mmol/L Tris pH 7.5 溶液 10 min；25% EtOH 和 100 mmol/L Tris pH 7.5 溶液 10 min 復水；使用 3% H2O2和 1% KOH 水溶液漂白脫色15 min 后用 ddH2O 洗 1 遍并保存于 50% 甘油。使用顯微鏡和相機對染色標本進行拍照，分別拍攝斑馬魚幼體頭部的左側面和腹面。使用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對胚胎的左側面鰓部骨骼進行分析，計算出鰓部匙骨、鰓弧骨、鰓蓋骨和鰓蓋條的染色面積總和及 IOD 值總和。以野生型對照組作為100%，各組數值都除以對照組的平均值，算出各組數值之后再求平均值和 SD，繪制柱狀圖。

圖2 化合物 G39 和 413 的合成Figure 2 Synthesis of compounds G39 and 413

1.2.2 實驗化合物 按照本實驗室優化的實驗方法［11］合成 G39，按文獻［15］報道方法合成 6-甲氧基-3-甲基苯并-2-羧酸（413），合成方法如圖 2 所示。商業購買結構母核分別為苯并呋喃（410）、苯并噻唑（412）、苯并噁唑（414）的 2 位乙酰取代物，以及苯并噻吩的 2 位羧基衍生物（411）（圖 1）。將待測化合物分為 2 批，評價各衍生物相同摩爾濃度下的抗骨質疏松活性差異。使用地塞米松斑馬魚模型對衍生物進行抗骨質疏松活性篩選，每批分別設置野生型對照組、G39 25 nmol/ml組、G39 5 nmol/ml 組、模型組、模型溶劑對照組、待測衍生物低劑量（1 nmol/ml）組、待測衍生物中劑量（5 nmol/ml）組與待測衍生物高劑量（25 nmol/ml）組。具體實驗操作同 1.2.1。

圖3 地塞米松斑馬魚骨質疏松模型鰓部骨骼礦化情況（箭頭所指為礦化區域）Figure 3 Bone status of dexamethasone zebrafish model （The mineralized zone was indicated by arrow）

圖4 茜素紅染色法考察 G39 對 6 dpf斑馬魚骨質疏松的改善作用（A：骨染色面積；B：光密度）Figure 4 G39 was studied the effect of alizarin red staining method by 6 dpf zebrafish osteoporosis （A： Staining area； B： Sum of optical density）

2 結果

2.1 G39 的活性測定

采用地塞米松斑馬魚骨質疏松模型進行先導物 G39 的活性測定，實驗結果如圖 3 所示，野生型對照組、地塞米松模型組、G39 1 和 5 μg/ml 組斑馬魚左側面茜素紅染色的顯微成像圖可見鈣化的骨礦化基質部位被染成了紅色，其他部位都無色透明。地塞米松組斑馬魚的染色面積明顯低于野生型對照組，這說明地塞米松顯著降低斑馬魚骨骼礦化程度，建模成功。與模型組相比，G39 1 和 5 μg/ml組骨染色面積明顯增加，其中，G39 5 μg/ml 組與野生型對照組骨染色面積幾乎一致。

使用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對胚胎的左側面鰓部骨骼進行分析，計算出鰓部匙骨、鰓弧骨、鰓蓋骨和鰓蓋條的染色面積總和及 IOD 值總和，以野生型對照組作為 100%，各組百分比數據處理結果如圖 4 所示。結果顯示，G39 1 和 5 μg/ml 與模型組相比均可顯著上調斑馬魚骨染色面積與骨染色光密度，提示先導物 G39 可改善地塞米松誘導的骨丟失。其中 G39 5 μg/ml 組上調效果好于G39 1 μg/ml 組，這種上調效應呈現出一定的劑量依賴關系，考慮在今后實驗時測定此類衍生物更大濃度的活性，尋找最優活性劑量。與野生對照組相比，G39 5 μg/ml 組可抵消大部分地塞米松產生的骨礦化損傷作用，斑馬魚骨礦化程度接近正常。

本實驗室前期使用同樣為激素骨質疏松模型的地塞米松大鼠骨質疏松模型對 G39 進行活性評價［16］，采用 Leica-Qwin 圖像分析儀系統，對不脫鈣骨切片進行形態計量，野生型對照組骨小梁體積百分比（TBV%）為（33.09 ± 5.15）%，模型組TBV% 為（18.46 ± 4.48）%，G39 組為（31.57 ± 11.33）%。參照斑馬魚實驗結果分析方法，將野生對照組作為 100%，數據處理結果如圖 5 所示。對比 G39 斑馬魚模型與大鼠模型活性評價實驗結果發現，兩者活性評價結果存在高度一致性，驗證了該地塞米松斑馬魚骨質疏松模型的有效性。

圖5 G39 地塞米松大鼠骨質疏松模型實驗結果Figure 5 Results of G39 dexamethasone rat mode

2.2 G39 衍生物的合成及活性篩選

按圖 2 合成得到 G39 及 413，商業購買其余衍生物，所有活性篩選實驗所需化合物結構如圖 1所示。

2.2.1 1-（苯并［b］噻吩-2-基）乙酮的合成 參照文獻［11］的方法合成，得淺黃色固體，收率 73%。具體分析如下：mp. 85 ～ 86 ℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3） δ（ppm）：2.66（s， 3H），7.40（t， J = 8.8 Hz，1H），7.47（t， J = 8.8 Hz， 1H），7.87（d， J = 8.8 Hz， 1H），7.89（d， J = 8.8 Hz， 1H），7.94（s， 1H）。 MS （EI+）：206。

2.2.2 6-甲氧基-3-甲基苯并-2-羧酸的合成 參照文獻［15］的方法合成，產率 88%。mp. 188 ～ 190 ℃。1H NMR（500 MHz， CDCl3）δ（ppm）：2.44（s， 3H），3.78（s， 3H），6.90（d， J = 8.5 Hz， 1H），7.15（s， 1H），7.58（d， J = 8.5 Hz， 1H），13.05（s， 1H）。MS（EI+）：176。

2.2.3 活性篩選 采用地塞米松斑馬魚骨質疏松模型分兩批進行一組 G39 的 2-乙酰苯并五元雜環衍生物抗骨質疏松活性篩選，分別設置空白組，模型組與 G39 組作為對照。實驗結束后使用Image-Pro Plus 6.0 軟件對胚胎的左側面鰓部骨骼進行分析，計算出鰓部匙骨、鰓弧骨、鰓蓋骨和鰓蓋條的染色面積總和及 IOD 值總和。使用 SPSS軟件進行單方差分析，數據處理結果如圖 6 所示。結果顯示，先導物 G39 25 nmol/ml 組在兩批實驗中與模型組相比均能顯著上調斑馬魚左側面骨染色面積與左側面骨染色光密度（P ＜ 0.001），數值與野生對照組相當，這說明 25 nmol/ml 的 G39 幾乎可完全抵消地塞米松的骨礦化損傷作用，抗骨質疏松活性顯著。G39 25 nmol/ml 組效果優于 G39 5 nmol/ml 組，活性呈現劑量依賴關系。苯并呋喃衍生物 410 在 25 nmol/ml 給藥濃度時活性與相同濃度 G39 組活性相當，而在5 nmol/ml 濃度下，410 活性優于相同濃度 G39。苯并噻唑衍生物 412活性比 G39 稍弱，但依然顯著上調斑馬魚左側面骨染色面積與左側面骨染色光密度（P ＜ 0.001），抗骨質疏松活性確切。將先導物 G39 乙?；鎿Q為羧基的衍生物 411 活性明顯降低，同樣含有羧基的衍生物 413 活性也不理想，這說明引入羧基這一變化對活性不利。

3 討論

本研究發現地塞米松斑馬魚骨質疏松模型可產生與地塞米松大鼠模型類似的骨質疏松狀態。以此模型評價先導物 G39 的抗骨質疏松活性，評價結果與大鼠模型具有很好的一致性。斑馬魚屬于低等脊椎動物，體積小且有完整骨骼，骨骼形成過程中參與調控的關鍵基因 runx2、osteonectin 等與哺乳動物的相關基因具有高度同源性。地塞米松斑馬魚骨質疏松模型的建立克服了傳統哺乳動物骨質疏松模型耗時長、效率差、靈敏度低、用藥量大的缺陷；克服了體外成骨和破骨細胞模型實驗條件苛刻、作用環節單一，難以體現體內綜合效應的缺陷。地塞米松斑馬魚骨質疏松模型的建立使體內抗骨質疏松活性評價周期大幅縮短，工作量大幅減少，提高科研效率和精度，使大量化合物抗骨質疏松體內活性篩選變為可能，為高效、準確發現抗骨質疏松候選化合物打下堅實的基礎。

圖6 茜素紅染色 6 dpf 斑馬魚幼體左側面骨染色面積及光密度總和Figure 6 Staining area and sum of optical density of left facial bone of 6 dpf zebrafish larvae with alizarin red staining

使用地塞米松斑馬魚骨質疏松模型篩選一組衍生物，得到活性優異的苯并呋喃結構化合物410，未見此類結構被報道具有抗骨質疏松活性。這一發現豐富了這類活性化合物的結構母核，為進一步設計新的苯并五元雜環衍生物，研究構效關系，進行新型抗骨質疏松藥物研發奠定了基礎。

志謝 感謝張靖溥老師課題組對本文斑馬魚實驗做出的幫助！

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Methods In groups， embryos from AB lines of 6 hpf zebrafish were incubated in dexamethasone solution for 72 h and drugs were then administered， respectively. Embryos were cultured till 6 dpf and then harvested followed by alizarin red staining， rehydration，decoloration， photomicrography， and analysis of staining results. Anti-osteoporosis activity screening experiments were carried out through the above steps in this dexamethasone zebrafish model. The experiments were divided into groups including wild type control， model control， model solvent control， and drug evaluation groups with various doses.

Results The 5 μg/ml G39 group showed significant activity in this dexamethasone zebrafish model， which is consistent with results from glucocorticoid rats model. Parallel screening of G39 derivatives was performed and it was discovered that benzofuran derivative 410 showed greater activity than G39 did.

Conclusion Due to its shortened evaluation cycle and low cost， dexamethasone zebrafish model makes it possible to evaluate the activities of anti-osteoporosis drugs in large quantities in vivo， laying a solid foundation for the faster and more accurate discovery of anti-osteoporosis drugs. An anti-osteoporosis compound 410， which shows a whole new structure and a greater activity than G39 does， is screened out through this study， and is worthy of further investigation.

Screening on antiosteoporotic 1-（benzo［b］thiophen-2-yl）ethanone analogues on zebrafish model

XUE Si-tu， QIN Wei， LIU Zong-ying， JIN Jie， CHEN Bo， LI Zhuo-rong

Objective To screen the anti-osteoporosis activities of lead compound G39 and its structural analogues using dexamethasone 6 -72 hpf zebrafish model.

Anti-osteoporosis； Zebrafish； 1-（benzo［b］thiophen-2-yl）ethanone； Activity screening

LI Zhuo-rong， Email： l-z-r@263.net

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.004

國家自然科學基金（81473097）

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所有機化學室

李卓榮，Email：l-z-r@263.net

2015-03-17

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術， 2015， 10（3）：211-217

Author Affiliation： Department of Medicinal Chemistry， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol， 2015， 10（3）：211-217