使用Corning?Transwell?滲透支持物進(jìn)行趨化性或侵襲試驗(yàn)的優(yōu)化考慮

Hilary Sherman，Pilar Pardo，Todd Upton

·技術(shù)與方法·

使用Corning?Transwell?滲透支持物進(jìn)行趨化性或侵襲試驗(yàn)的優(yōu)化考慮

Hilary Sherman，Pilar Pardo，Todd Upton

趨化性和侵襲試驗(yàn)對(duì)于研究傷口愈合、細(xì)胞分化、細(xì)胞通訊、胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移是有幫助的。由于這些生物體系的復(fù)雜性，對(duì)建立結(jié)構(gòu)清晰、具重現(xiàn)性的研究模型進(jìn)行優(yōu)化是必不可少的。盡管已有對(duì)于已知的化學(xué)誘導(dǎo)物、細(xì)胞接種密度和孵育時(shí)間的資料可用，但是對(duì)于特定的模型系統(tǒng)所知信息仍然有限。以下內(nèi)容著重討論使用通透性支持物進(jìn)行趨化性和侵襲試驗(yàn)時(shí)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和獲取精確結(jié)果所需要考慮的重要因素。

選擇正確的 Transwell 通透性支持物系統(tǒng)

趨化性和侵襲試驗(yàn)的一個(gè)最至關(guān)重要的因素就是選擇合適的 Transwell 通透性支持物。其主要需考慮兩個(gè)方面，哪種孔徑可獲得最理想的結(jié)果，哪種形式最適用于測(cè)試。孔徑取決于使用的遷移細(xì)胞。如果孔徑太小，將沒(méi)有空間進(jìn)行遷移，因?yàn)榧?xì)胞不能簡(jiǎn)單地通過(guò)改變它們的形狀來(lái)穿過(guò)孔。而另一方面，如果孔徑太大，細(xì)胞可能直接從孔中落下造成不精確的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)，小細(xì)胞如白細(xì)胞推薦使用 3.0 μm 孔，更大細(xì)胞如內(nèi)皮和上皮細(xì)胞用 5.0 μm 或者8.0 μm 孔。

選擇合適的 Transwell 體系時(shí)，應(yīng)考慮到想要獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的高質(zhì)量數(shù)據(jù)需要多少孔（包括復(fù)孔和對(duì)照）。建議每個(gè)樣品至少 3 個(gè)重復(fù)。正確的對(duì)照對(duì)于理解和證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣重要。趨化性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照包括不含化學(xué)誘導(dǎo)物的孔（陰性對(duì)照）和帶有已知化學(xué)誘導(dǎo)物的孔（陽(yáng)性對(duì)照）。另外，使用含有非轉(zhuǎn)移細(xì)胞的孔（內(nèi)有化學(xué)誘導(dǎo)物）（如MCF7 在 FBS 中）也可有助于確定其中有無(wú)非自發(fā)性轉(zhuǎn)移發(fā)生。操作侵襲試驗(yàn)時(shí)，對(duì)照包括不含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白屏障來(lái)評(píng)估遷移和侵襲的差別，此外，包含一個(gè)非侵襲細(xì)胞系的孔對(duì)于確定屏障確實(shí)阻止了侵襲也很重要（如 NIH3T3）。了解所需的對(duì)照和樣品能夠幫助確定選擇何種 Transwell微孔板（如 24 孔 Transwell 嵌套或者高通量篩選 HTS Transwell-96 微孔板）。

計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞

選擇合適的方法來(lái)計(jì)數(shù)遷移（侵襲）細(xì)胞是趨化性試驗(yàn)的重要部分。方法的選擇取決于多種因素，包括可用的設(shè)備、試劑價(jià)格、細(xì)胞類(lèi)型和分析的通量。如果細(xì)胞是非貼壁的，可簡(jiǎn)單地收集在儲(chǔ)藏微孔板中，然后可用多種計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，如血球計(jì)數(shù)板、流式細(xì)胞儀或者活細(xì)胞染色試驗(yàn)（如MTT、熒光染色）。如果細(xì)胞是貼壁的，可輕輕擦拭通透性支持物膜的頂端移除未遷移的細(xì)胞，然后固定、染色遷移到膜下層的細(xì)胞。在膜上固定和染色細(xì)胞可使用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)確定遷移或侵襲百分比（圖 1 和圖 2）。使用這種方法計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)確保計(jì)數(shù)足夠多的區(qū)域，才能正確代表細(xì)胞總數(shù)，因?yàn)橛袝r(shí)細(xì)胞傾向遷移到嵌套的中心或者邊緣。其他常見(jiàn)計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞的方法包括從膜上解離或者裂解細(xì)胞，然后使用不同的試劑或者試驗(yàn)試劑盒來(lái)計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞（如鈣黃綠素AM）。盡管第二種細(xì)胞計(jì)數(shù)方法成本更高，但是它速度更快，能夠提高通量和減少差異。對(duì)于有關(guān)分離或標(biāo)記細(xì)胞用來(lái)計(jì)數(shù)的更多信息請(qǐng)參考文獻(xiàn)圖書(shū)館 http://www.corning. com/lifesciences 中的化學(xué)遷移和侵襲方案。

圖1 HT1080 細(xì)胞掃描電鏡圖片（× 500）

圖2 遷移細(xì)胞染色［HT1080 在 5.0 μm 聚碳酸酯膜上結(jié)晶紫染色（× 48）］

優(yōu)化接種密度

使用最理想的接種密度是細(xì)胞遷移試驗(yàn)中的另一個(gè)重要的因素，可以確保獲得最高的信噪比。如果使用細(xì)胞太少，由于樣品數(shù)量太小，沒(méi)有足夠的細(xì)胞通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行精確的計(jì)數(shù)。相反的是，如果細(xì)胞太多，孔中細(xì)胞過(guò)飽和，計(jì)數(shù)區(qū)域或者試驗(yàn)信號(hào)可能導(dǎo)致結(jié)果不精確。用已知的化學(xué)誘導(dǎo)物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定用于分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)最理想的細(xì)胞接種密度（圖 3）。

圖3 遷移試驗(yàn)中接種密度的重要性（優(yōu)化 HT1080 接種密度，用于 24 h 遷移穿過(guò) 8.0 μm 聚碳酸酯膜）

優(yōu)化化學(xué)誘導(dǎo)物濃度

化學(xué)誘導(dǎo)物對(duì)于每一個(gè)遷移或者侵襲試驗(yàn)的成功至關(guān)重要。因而，當(dāng)決定使用哪種化學(xué)誘導(dǎo)物時(shí)，測(cè)定多個(gè)濃度可能大有益處。可利用系列梯度稀釋的化學(xué)誘導(dǎo)物來(lái)選擇最佳濃度。此外，如果條件允許，可選擇多個(gè)濃度進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)，以確保最終選擇最佳實(shí)驗(yàn)體系（圖 4）。

圖4 化學(xué)誘導(dǎo)物濃度的重要性（優(yōu)化血清密度，用于HT1080 24 h 內(nèi)遷移穿過(guò) 8.0 μm 聚碳酸酯膜）

遷移（侵襲）時(shí)間

如果使用一個(gè)研究成熟的模型，遷移時(shí)間可能已有記錄，否則，需要首先進(jìn)行優(yōu)化。有多個(gè)因素決定細(xì)胞穿過(guò)通透性支持物孔所需的時(shí)間。包括化學(xué)誘導(dǎo)物類(lèi)型（濃度）、細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)和屏障厚度（濃度）。因而，優(yōu)化用于特定條件的遷移時(shí)間很重要。對(duì)于某些應(yīng)用，2 h 的遷移時(shí)間足夠用來(lái)獲得滿(mǎn)意的結(jié)果，而其他應(yīng)用可能需要 24 h 或者48 h。更長(zhǎng)的孵育時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致更高的自發(fā)遷移，從而有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也很重要（圖 5）。

圖5 遷移（侵襲）時(shí)間對(duì)遷移的影響（優(yōu)化 HT1080 24 h遷移穿過(guò) 8.0 μm 聚碳酸酯膜的遷移時(shí)間）

屏障類(lèi)型和濃度

侵襲試驗(yàn)要求遷移通過(guò)某種生物學(xué)屏障。通常用于侵襲試驗(yàn)的屏障包括細(xì)胞外基質(zhì)（如 BME 和 Matrigel?）、膠原蛋白、纖粘連蛋白和層粘連蛋白，以及其他成分明確復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜提取物。屏障選擇取決于檢測(cè)的模型和想要包被的濃度。為了測(cè)定正確的包被濃度，除了測(cè)試作為對(duì)照的無(wú)包被的孔，也測(cè)試不同的包被濃度。如果屏障起作用，未經(jīng)包被孔的遷移細(xì)胞數(shù)與包被屏障孔的遷移細(xì)胞數(shù)將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 6）。

圖6 包被濃度的重要性（在 4 h 或者 24 h，HT1080 侵襲通過(guò) 8.0 μm 聚碳酸酯膜上不同膠原濃度）

制備用于趨化性試驗(yàn)的細(xì)胞

某些應(yīng)用中，操作遷移試驗(yàn)前必須用血清饑餓細(xì)胞24 ～ 48 h。血清饑餓能夠增加細(xì)胞對(duì)于化學(xué)誘導(dǎo)物的敏感性，因而增加遷移應(yīng)答也能夠減少潛在的差異。從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)基，用 PBS 或 HBSS 淋洗，然后用相同體積的無(wú)血清或者血清減少的培養(yǎng)基來(lái)代替使用。除了饑餓細(xì)胞，可能優(yōu)化收獲細(xì)胞的方法也是必需的。取決于使用的細(xì)胞類(lèi)型和化學(xué)誘導(dǎo)物，某些蛋白酶（如胰蛋白酶）可能會(huì)因?yàn)閾p傷細(xì)胞或者細(xì)胞表面受體減少而抑制細(xì)胞遷移（圖 7）。

圖7 細(xì)胞收獲溶液的重要性（用 Accutase? 和胰蛋白酶收獲 HT1080 細(xì)胞的 24 h 遷移結(jié)果）

討論

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化對(duì)于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)獲得穩(wěn)定的可重現(xiàn)結(jié)果至關(guān)重要。由于遷移和侵襲試驗(yàn)的復(fù)雜性，使得優(yōu)化更為重要。細(xì)胞的總體健康狀況、接種條件、化學(xué)誘導(dǎo)物濃度、膜孔徑和遷移（侵襲）孵育時(shí)間，是遷移（侵襲）試驗(yàn)中需要考慮的幾個(gè)至關(guān)重要的因素。這些至關(guān)重要的因素的優(yōu)化不但會(huì)獲得更精確的結(jié)果，而且能夠節(jié)省時(shí)間和成本。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.016

200040 上海，康寧生命科學(xué)亞洲技術(shù)中心

2015-05-12