抗丙型肝炎藥物研究進(jìn)展
——藥物、靶點(diǎn)和耐藥性

石星，葛慶華，岑山

綜述

抗丙型肝炎藥物研究進(jìn)展
——藥物、靶點(diǎn)和耐藥性

石星，葛慶華，岑山

丙型肝炎為丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的全球性傳染病。目前全球感染率約為 3%，感染者約2 億人［1］。我國(guó)在 2010 年公布了一般人群的血清抗 HCV陽(yáng)性率為 0.43%。丙型肝炎以輸血為主要傳播途徑。15% ～40% 的感染者 6 個(gè)月內(nèi)感染癥狀可自行消失［2-3］，剩余60% ～ 85% 發(fā)展為慢性丙型肝炎［4］，其中約 20% 的慢性丙型肝炎患者在慢性感染 HCV 后 20 年左右的時(shí)間內(nèi)發(fā)展為肝硬化甚至肝臟衰竭或 HCV 相關(guān)的肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［5］。目前丙型肝炎的預(yù)防尚無(wú)疫苗可用。早期最有效的丙型肝炎標(biāo)準(zhǔn)治療方案是聚乙二醇（PEG）化干擾素 α（PEG-IFN-α）與利巴韋林（ribavirin，RBV）聯(lián)合應(yīng)用 24 ～ 48 周，但只有 40% ～ 50% 的基因型為 1 型患者和約 80% 的基因型為 2 或 3 型患者得到有效治愈［6-8］。2011 年，新的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法獲美國(guó) FDA 認(rèn)證，該療法在傳統(tǒng)抗丙型肝炎標(biāo)準(zhǔn)方案（PEG-IFN-α 和利巴韋林聯(lián)合用藥）基礎(chǔ)上加入了兩種新批準(zhǔn)的蛋白酶抑制劑中的一種，使得對(duì) HCV 基因 1 型感染治愈率提高到約70%［9-10］，但是其副反應(yīng)、抗藥性以及藥物間相互作用等問(wèn)題依然嚴(yán)重［11］。

1 抗丙型肝炎病毒藥物和靶點(diǎn)

丙型肝炎病毒為有包膜單股正鏈 RNA 病毒，屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬（Flaviviridae hepacivirus）。根據(jù)其基因序列的差異程度分為 7 個(gè)基因型以及多個(gè)亞型。HCV 基因組全長(zhǎng)約為 9.6 kb，僅含有一個(gè)大的開(kāi)放讀碼框，編碼大約 3000 個(gè)氨基酸殘基的多蛋白前體。該蛋白前體由宿主或病毒的水解酶加工成 10 個(gè)成熟的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，從N 端到 C 端依次為 Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。HCV 生活周期大致包括病毒吸附、進(jìn)入細(xì)胞、脫衣殼、病毒多蛋白翻譯、剪切、復(fù)制復(fù)合物組裝、病毒基因組復(fù)制、病毒顆粒組裝、成熟和釋放等幾個(gè)環(huán)節(jié)。理論上，HCV 生活周期的每一步都可以成為藥物靶點(diǎn)［12］。目前，抗 HCV 藥物的靶點(diǎn)多選擇病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，如 NS2、NS3、NS4A、NS5A 和 NS5B。NS2/3 蛋白水解酶負(fù)責(zé) NS2 和 NS3 的分子內(nèi)切割。切割釋放后的NS2 以反式作用的方式與 NS5A 系統(tǒng)作用參與感染性病毒顆粒的形成。NS3 則在切割后其 N-端具有絲氨酸蛋白酶活性得以釋放，可切開(kāi) NS3/4A、NS4A/4B、NS4B/5A、NS5A/5B 的連接部位，使得非結(jié)構(gòu)蛋白成熟。NS3 C 端結(jié)構(gòu)域具有的 NTP 酶（NTPase）和 RNA 解旋酶活性為HCV 復(fù)制所必需。NS4A 為疏水性蛋白，由 54 個(gè)氨基酸組成，可與 NS3 的 N 端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，穩(wěn)定NS3 的蛋白酶構(gòu)型，NS3/4A 可切割宿主抗病毒天然免疫中關(guān)鍵蛋白。NS5A 為多功能高度磷酸化蛋白，其參與了病毒復(fù)制復(fù)合物的形成、病毒的產(chǎn)生及釋放和干擾細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)通路等。NS5B 分子量為 68 kD，為 RNA 依賴(lài)的 RNA聚合酶（RdRp），主要生物學(xué)功能為合成 HCV 基因組或與之互補(bǔ)的負(fù)鏈 RNA。

目前已有多種直接作用病毒和以宿主為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入臨床前階段或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。直接作用抗病毒藥物（direct-acting agent，DAA）主要通過(guò)抑制 HCV 編碼的酶或蛋白的功能來(lái)發(fā)揮抗病毒作用。宿主靶向藥物（host-targeting agents，HTAs）是通過(guò)增強(qiáng)宿主天然免疫或干預(yù)發(fā)病機(jī)制所需的宿主因素，間接影響 HCV 復(fù)制的一類(lèi)藥物。

抗丙肝病毒藥物療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括快速病毒學(xué)應(yīng)答（rapid virological response，RVR）、早期病毒學(xué)應(yīng)答（early virological response，EVR）和持續(xù)病毒應(yīng)答（sustained virological response，SVR）［13-14］。RVR、EVR 和 SVR 一般分別代表抗病毒治療第 4 周、12 周、治療結(jié)束及隨訪期間的病毒學(xué)應(yīng)答。RVR 指治療 4 周時(shí)血清 HCV RNA 的PCR 結(jié)果陰性，SVR 指血清 HCV RNA 在治療結(jié)束及隨訪期間 PCR 檢查均陰性。SVR12 指治療終點(diǎn)后 12 周隨訪時(shí) HCV RNA 陰性（一般應(yīng)用于 FDA 接受的臨床試驗(yàn)終點(diǎn)）。本文主要對(duì)已經(jīng)進(jìn)入臨床階段的藥物進(jìn)行總結(jié)。

2 直接作用抗病毒藥物

2.1 NS3/4A 蛋白酶抑制劑

此類(lèi)藥物主要為多肽模擬物，作用靶點(diǎn)為 HCV NS3/4A蛋白酶活性位點(diǎn)，目前已研發(fā)到第二代。藥物通過(guò)與NS3/4A 的結(jié)合阻斷其剪切病毒多蛋白，影響病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的成熟。該類(lèi)抑制劑在服用數(shù)天后可使 HCV RNA 下降3.5 ～ 4.5 log10IU/ml。特拉瑞韋（telaprevir）、波普瑞韋（boceprevir）、司美匹韋（simeprevir，TMC435）和 faldaprevir（圖 1）為第一代 NS3/4A 蛋白酶抑制劑，前三種藥物已經(jīng)獲得美國(guó) FDA 認(rèn)證，faldaprevir 的研究也已進(jìn)入臨床III 期階段。

特拉瑞韋和波普瑞韋對(duì)基因 1 型 HCV 產(chǎn)生 SVR 比率分別提高到 75% 和 67%。司美匹韋單獨(dú)給藥 150 mg/d或與 IFN/RBV 聯(lián)合應(yīng)用，SVR24（治療后 24 周持續(xù)病毒應(yīng)答）分別為 67% ～ 80% 和 81% ～ 86%，而 IFN/RBV 組只有 23%［15］。雖然 NS3/4A 蛋白酶抑制劑的加入大幅度提高了 IFN/RBV 的 SVR 比率，但由于 HCV 復(fù)制過(guò)程中可產(chǎn)生大量突變，第一代藥物在服用后極短時(shí)間（幾天到數(shù)周）內(nèi)，單一藥物治療便會(huì)產(chǎn)生抗藥性［16-17］，常見(jiàn)的 NS3 突變位點(diǎn)有 Q80K、R155K、V36M/R155K、A156T 和 D168A。目前第二代藥物的研發(fā)正朝著減少藥物間相互作用、劑量減少、療程縮短和減弱副作用的方向進(jìn)行。MK-5172 是其中比較有潛力的藥物，該藥物已進(jìn)入臨床 II 期試驗(yàn)階段。相較于第一代蛋白酶抑制劑，MK-5172 副反應(yīng)相對(duì)較弱，對(duì)于 HCV 基因 1 型和 3 型有效，400 mg/d 連續(xù)服用 7 d，HCV RNA 分別下降了 5.4 和 3.98 log10IU/ml，患者的IL28B 基因型對(duì)其 SVR24 無(wú)影響，且對(duì)于臨床常見(jiàn) NS3 R155 突變有較強(qiáng)抗性［18］。

2.2 NS5A 抑制劑

鑒于 HCV NS5A 在病毒復(fù)制和組裝過(guò)程中有重要作用［19-20］，該類(lèi)抑制劑在與 IFN/RBV 聯(lián)合用藥時(shí)可以顯著減少 HCV RNA 并增強(qiáng) SVR［21］。目前該類(lèi)藥物極有潛力成為對(duì) HCV 所有基因型有效的藥物。本文以達(dá)卡他韋（daclatasvir，BMS-790052）和雷迪帕韋（ledipasvir，GS-5885）為例介紹該類(lèi)化合物（圖 2）。

圖1 第一代 NS3/4A 蛋白酶抑制劑

圖2 NS5A 抑制劑

達(dá)卡他韋是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的 NS5A 抑制劑。體外試驗(yàn)表明，該藥物對(duì) HCV 所有基因型均表現(xiàn)出較高抗病毒活性。達(dá)卡他韋作用于 NS5A 蛋白 N 端結(jié)構(gòu)域 I，該結(jié)構(gòu)域?qū)?NS5A 寡聚化至關(guān)重要。達(dá)卡他韋獨(dú)特的回文結(jié)構(gòu)正好與 NS5A 二聚體互補(bǔ)，其結(jié)合于兩個(gè)NS5A 分子 N 端結(jié)構(gòu)域 I 固相片段（36-198 和 33-191氨基酸殘基）形成二聚體的界面，處于推定的 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域反向［22-24］。達(dá)卡他韋有可能通過(guò)干擾 NS5A 二聚體的精確結(jié)合，使得空間結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微扭曲，從而影響 NS5A 功能［21］。目前認(rèn)為，達(dá)卡他韋影響了 HCV 生活周期的兩個(gè)階段——病毒 RNA 合成和病毒顆粒組裝/分泌過(guò)程［25］。I 期臨床試驗(yàn)表明，服用達(dá)卡他韋 100 mg 6 h 后病毒載量就有平均 1.95 log10IU/ml 的下降，這比目前任何抗病毒藥物都要快。臨床 II 期試驗(yàn)結(jié)果顯示，HCV 基因 1 型患者在接受達(dá)卡他韋 3、10 和 60 mg 與 IFN/RBV 連用治療后，RVR 分別為 42%、83% 和 75%［26］。雖然達(dá)卡他韋對(duì)所有 HCV 基因型有效，但耐藥性依然存在，早期實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)達(dá)卡他韋單一療法很快會(huì)有抗藥病毒株出現(xiàn)，常見(jiàn)突變位點(diǎn)為 M28T、Q30H/R、L31M/V、Y93H/C 等［21］。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)抗達(dá)卡他韋和其他 DAA 的交叉耐藥株，因此達(dá)卡他韋在無(wú) IFN 的治療方案中有較好前景［27］。

雷迪帕韋目前處于 III 期臨床試驗(yàn)階段，是泛基因型抗HCV 藥物。體外試驗(yàn)表明，雷迪帕韋可有效抑制 HCV 基因型 1a、1b、2、3、4a 和 6a，細(xì)胞毒性低且其抗 HCV 有特異性［28］。I 期臨床試驗(yàn)表明，HCV 基因 1 型患者日服30 mg，共服用 3 d，HCV RNA 下降 3.3 log10IU/ml。未見(jiàn)有嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)道［29］。但體外復(fù)制子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷迪帕韋的抗藥株，例如基因 1a 型的 NS5A Q30H 和 Y93H 突變株［28］。

除了上述兩個(gè)藥物，ACH-3102 是另外一個(gè)極有潛力的第二代泛基因型 HCV NS5A 抑制劑，已進(jìn)入 II 期臨床試驗(yàn)。臨床前和 I 期臨床試驗(yàn)表明，ACH-3102 對(duì) HCV 基因 1 型的主要耐藥株及 HCV 基因 2 ～ 6 型，以及攜有L31M 突變的基因 2 型抗性株均有顯著療效。同時(shí)，ACH-3102 半衰期長(zhǎng)達(dá) 250 h，遠(yuǎn)優(yōu)于達(dá)卡他韋（13 ～ 15 h）、雷迪帕韋（22 ～ 50 h）和 ABT-267（25 ～ 32 h）［30］。

2.3 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶抑制劑（NS5B 抑制劑）

NS5B 是 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶（RdRp），是 HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶。NS5B 抑制劑分為兩類(lèi)：一類(lèi)為核苷/核苷酸類(lèi)抑制劑（NPIs），另一類(lèi)為非核苷類(lèi)抑制劑（NNPIs）。

2.3.1 核苷/核苷酸類(lèi) NS5B 抑制劑 該類(lèi)抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到 NS5B 聚合酶活性位點(diǎn)，導(dǎo)致新生病毒基因組合成的終止，從而抑制 HCV 的復(fù)制［31］。NS5B 活性位點(diǎn)在所有 HCV 基因型高度保守，因此 NPIs 具有泛基因型的特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，但是該類(lèi)藥物往往有較大毒性（圖 3）。

索非布韋（sofosbuvir，GS-7977）于 2013 年獲美國(guó)FDA 批準(zhǔn)［32］。索非布韋是一種藥物前體，在肝內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為活性抗病毒劑 2'-脫氧-2'-α-氟-β-C-甲基尿苷-5'-三磷酸酯，然后與核苷酸競(jìng)爭(zhēng) HCV NS5B 活性位點(diǎn)，最終導(dǎo)致HCV 早期 RNA 鏈合成的終止［33-34］。I 期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)服用索非布韋 400 mg/d 連續(xù) 3 d可使 HCV RNA下降 3.9 log10IU/ml，且對(duì) HCV 所有基因型有效。II 期臨床試驗(yàn)也表明，索非布韋（400 mg/d）與 IFN/RBV 聯(lián)合用藥治療 12 周對(duì) HCV 基因 1、2、3、4 和 6 型 SVR 比率大于 87%。對(duì)于初治無(wú)肝硬化的基因 1 型患者，索非布韋（400 mg/d）與 IFN/RBV 聯(lián)合用藥治療 12 周，SVR 比率為 91%，此外 IL28B 基因多態(tài)性對(duì)治療效果無(wú)影響［35-36］。索非布韋的抗病毒作用不受患者感染 HCV 基因型、種族、IL28B 基因型及有無(wú)肝硬化等因素的影響。患者對(duì)索非布韋副反應(yīng)有較好耐受性。

Mericitabine（RG7128）為一胞嘧啶核苷酸類(lèi)似物的前藥，因其耐受性和安全性好，是極具潛力的抗丙型肝炎藥物。臨床試驗(yàn)表明，mericitabine 對(duì)基因 1、2、3 和 4 型有效且不易產(chǎn)生耐藥性［18］。當(dāng)治療周期延長(zhǎng)至 24 周時(shí)，SVR 率上升到 56.8%，且患者有較好耐受性［37］。

2.3.2 非核苷類(lèi) NS5B 抑制劑 NNPIs 作為單一療法的抑制劑抗病毒能力低于 NS3 蛋白酶抑制劑。NS5B 上有4 個(gè)該類(lèi)化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域——拇指結(jié)構(gòu)域 1 和 2 以及手掌結(jié)構(gòu)域 1 和 2。該類(lèi)化合物只對(duì) HCV 基因 1 型有效，病毒較易對(duì)此類(lèi)藥物產(chǎn)生抗性（圖 4）。

Deleobuvir（BI-207127）是口服類(lèi) NNPI，靶點(diǎn)為 NS5B拇指結(jié)構(gòu)域 1，目前已進(jìn)入臨床 III 期試驗(yàn)。在基因型 1b HCV 感染者中，應(yīng)用 deleobuvir 的 SVR12 達(dá)到了 56% ～85%，比 1a 基因型要高，后者為 11% ～ 47%［38］。該藥物與IFN/RBV 聯(lián)合治療耐受性較好，不良反應(yīng)多為輕度皮疹、惡心和腹瀉等［39-40］。

VX-222 也是口服類(lèi) NNPI，靶點(diǎn)為 NS5B 拇指結(jié)構(gòu)域 2。I 期臨床表明，HCV 基因 1 型患者接受每天 2 次，750 mg/次給藥，治療 3 d后，HCV RNA 水平平均下降3.7 log10IU/ml，且藥物耐受性好，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，一般為疲勞和腸胃不適。當(dāng) VX-222 以高劑量與 RBV 和特拉瑞韋三聯(lián)治療或加入 PEG-IFN 四聯(lián)治療 HCV 基因 1 型患者時(shí)，三聯(lián)療法在治療第二周 HCV 檢測(cè)即為陰性，四聯(lián)療法 SVR12 率達(dá)到 90%［41］。

圖3 核苷/核苷酸類(lèi) NS5B 抑制劑

圖4 非核苷類(lèi) NS5B 抑制劑

Tegobuvir（GS-9190）靶點(diǎn)為 NS5B 手掌結(jié)構(gòu)域 2，可使 HCV RNA 下降 1.7 log10IU/ml。臨床 II 期試驗(yàn)將tegobuvir 與 IFN/RBV 聯(lián)合用于基因型 1 患者治療，SVR率可達(dá) 100%［42］。

Setrosbuvir 的靶點(diǎn)為 NS5B 的手掌結(jié)構(gòu) 1，HCV 基因 1 型患者接受每天 2 次，800 mg/次給藥，治療 3 d 后，HCV RNA 水平平均下降 2.9 log10IU/ml，但體外研究顯示，HCV 基因 2 型和 3 型對(duì)其具有一定抗性。

3 以宿主為靶點(diǎn)的藥物

研發(fā)增強(qiáng)宿主天然免疫或干預(yù)發(fā)病機(jī)制所需的宿主因素的藥物（host-targeting agents，HTAs）是 HCV 感染防治的重要手段之一。該類(lèi)藥物大致分為兩類(lèi)：一類(lèi)為多靶點(diǎn)HTAs，通過(guò)觸發(fā)固有免疫反應(yīng)促使宿主處于抗病毒狀態(tài)，包括 IFNα、IFNλ 以及 Toll 樣受體（toll like receptor，TLR）抑制劑等；另一類(lèi)為單靶點(diǎn) HTAs，主要針對(duì) HCV 生活周期中必需的關(guān)鍵宿主酶和因子，例如親環(huán)素A（CypA）、脂肪酸合酶（FASN）、HMGCoA 脫氫酶和 miRNA-122 等［43］。

ITX-5061 在體外抑制 HCV 侵入細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵受體SR-B1，從而阻止 HCV 的復(fù)制。該藥早先作為治療炎癥疾病藥物—— p38 MAPK 抑制劑研發(fā)的，但是其抗病毒作用并不依賴(lài)于其 p38 MAPK 抑制活性，目前已進(jìn)入 II 期臨床試驗(yàn)。HCV E2 蛋白 N415D 和 G451R 突變株對(duì)ITX-5061 產(chǎn)生顯著耐藥性，但是卻對(duì)于中和抗體更為敏感［44］。

Alisporivir（DEBIO-025）和 SCY-635 靶點(diǎn)為 HCV 復(fù)制過(guò)程中必需的肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶——親環(huán)素A，阻止親環(huán)素 A 與 NS5A 結(jié)構(gòu)域 II 上的脯氨酸結(jié)合，影響CypA 與 NS5A 之間相互作用，從而抑制 HCV 在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。Alisporivir 還可以通過(guò)與親環(huán)素 D 結(jié)合，抑制線粒體通透性變換，從而拯救由 HCV 引起的線粒體功能紊亂［45］。此外，SCY-635 還可以通過(guò)誘導(dǎo) I 型和 III 型干擾素及 ISGs 增強(qiáng)天然抗病毒免疫［46］。臨床試驗(yàn)中，由于受試者有幾例急性胰腺炎患者出現(xiàn)，因此 alisporivir 的臨床試驗(yàn)?zāi)壳耙呀?jīng)暫停。

Miravirsen 是鎖核酸修飾的硫代反義寡核苷酸，靶標(biāo)是肝臟內(nèi)特異表達(dá)并對(duì) HCV 基因組的穩(wěn)定性和復(fù)制所必需的 miR-122［47-49］。它可與 miR-122 形成高度穩(wěn)定的雜交雙鏈，從而抑制其功能［50-51］。臨床 II 期研究表明，miravirsen用于慢性 HCV 1 型感染患者表現(xiàn)出長(zhǎng)期劑量依賴(lài)性地減少 HCV-RNA 水平的效應(yīng)。皮下注射劑量為 3、5 或7 mg/kg的 miravirsen 治療組患者的平均 HCV-RNA 最大值（log10IU/ml）自基線水平的減少量分別為 1.2、2.9 和 3.0。同時(shí)未觀察到劑量限制性的不良反應(yīng)事件及病毒抵抗性。

4 結(jié)語(yǔ)

二十多年來(lái)，隨著對(duì)丙型肝炎病毒研究的日益深入，新藥物新療法不斷出現(xiàn)。特別是近幾年，抗 HCV 藥物和新策略發(fā)展十分迅速［52-55］。盡管新的 DAA 藥物已成為臨床治療的一線藥物，慢性丙型肝炎的治療依然面臨諸多挑戰(zhàn)，例如疾病預(yù)防、病毒耐藥性、藥物交叉反應(yīng)、新藥安全性和有效性等。新的抗 HCV 藥物、多個(gè)靶點(diǎn)藥物混合制劑以及泛基因型抗病毒藥物將會(huì)是未來(lái)治療慢性丙型肝炎及藥物研發(fā)的趨勢(shì)。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.011

十二五“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09301002-001-015、2012ZX09301002-005-002）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室

岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2015-03-05