依博素生物合成基因ste22的異源置換研究

郭連宏，張洋，鮑勇剛，白利平，姜蓉，李元

依博素生物合成基因ste22的異源置換研究

郭連宏*，張洋*，鮑勇剛，白利平，姜蓉，李元

目的 依博素是由鏈霉菌產生的一種新型胞外多糖，具有顯著抗類風濕性關節炎的作用，我們研究已確定了該多糖的生物合成基因簇（ste）。為了對依博素結構進行改造以提高其生物活性，對其生物合成基因 ste22 進行了異源置換研究。方法 采用 PCR 擴增方法從乳酸菌獲得了編碼葡萄糖糖基轉移酶的基因 gtf，通過基因同源重組雙交換，從鏈霉菌中置換了 ste22 基因。采用白細胞介素-1 合成酶活性測定方法及小鼠巴豆油急性炎癥模型，初步確定了基因置換株的依博素衍生物生物活性。

異源基因置換； 基因 gtf； 基因 ste22； 鏈霉菌； 乳酸菌

類風濕性關節炎（RA）是一種自身免疫性疾病，嚴重影響身體健康，目前尚缺乏有效治療手段。本課題組從鏈霉菌 139（Streptomyces sp.139）的發酵液中成功分離獲得了一種微生物新型胞外多糖，命名為依博素［1］。藥效學證明其對大鼠 II 型膠原誘導的類風濕性關節炎模型和佐劑型類風濕性關節炎模型均有顯著抑制作用［2］。作用機制研究證明其對白細胞介素-1β（interlukin-1β，IL-1β）等主要炎癥細胞因子的生成及信號傳導途徑有明顯抑制活性［3］，依博素有可能發展為治療 RA 的新藥。

我們的研究已確定依博素的生物合成基因簇（ste）由 27 個開放閱讀框架組成［4］，對基因編碼產物的生物功能已進行了較深入研究［5-7］，其中基因ste22 編碼產物被確認為鼠李糖糖基轉移酶［8］。糖基轉移酶在微生物胞外多糖（EPS）的生物合成過程中起重要作用，在多糖生物合成基因簇中引入異源糖基轉移酶基因有可能改變多糖結構獲得新衍生物，并可驗證被置換基因功能及多糖構效關系。鑒于乳酸菌與鏈霉菌同屬革蘭陽性菌，且其多糖生物合成基因簇中葡萄糖糖基轉移酶基因研究較深入，因此本文采用 PCR 擴增方法，從產生胞外多糖的乳酸菌基因組獲得其多糖生物合成簇的葡萄糖糖基轉移酶基因。以缺失基因 ste22（編碼鼠李糖糖基轉移酶）的依博素產生菌突變株為受體菌，通過基因同源重組雙交換將葡萄糖糖基轉移酶基因 gtf置換至依博素生物合成基因簇中，Southern 雜交驗證獲得了基因置換菌株 Streptomyces sp.139 （gtf-22），分離純化了該菌株產生的胞外多糖EPS-22g，結果表明其單糖組分與依博素相比葡萄糖比例有顯著提高，體內外活性研究結果初步證明該衍生物較依博素活性有所提高。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 Streptomyces sp.139（依博素產生菌）、ste 22 基因阻斷株 Streptomyces sp.139 （ste22ˉ）、E.coli DH5α、E.coli ET12567［9］及 E. coli BL21（DE3）均為本實驗室保存；Streptococcus thermophilus 購自中國工業微生物菌種中心，CICC編號 20370。

1.1.2 質粒 pKC1139［10］、pGEM-3zf-ErmE*、pGEM-T-tsr 和 pKC22 均為本實驗室保存。

1.1.3 培養基 依博素產生菌 Streptomyces sp.139 及基因阻斷株發酵培養基：葡萄糖 1.0%、淀粉 1.0%、黃豆餅粉 2.0%、胰蛋白胨 0.2%、牛肉膏 0.2%、酵母提取物 0.4%、K2HPO40.05%、CaCO30.3%，pH 7.2 ～ 7.4；乳酸菌（嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus）培養基（CM0005）：蛋白胨 1%、麥芽提取物 1%、酵母提取物 0.5%、葡萄糖 0.5%、醋酸鈉 0.5%、檸檬酸氫銨 0.2%、吐溫 80 0.1%、K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、MnSO4·H2O 0.005%、CaCO32%，pH 7.0。

1.1.4 動物 雄性昆明小鼠，體重 18 ～ 20 g，中國醫學科學院實驗動物研究所提供。合格證號：SCXK（京）2005-0013。動物飼養及實驗過程遵循中國醫學科學院實驗動物管理規定。

1.1.5 試劑 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、pfu 高保真 DNA 聚合酶、RNase、溶菌酶等分別購自 Promega、TaKaRa 公司；DNA 片段純化試劑盒購自 SunBio；Southern雜交試劑盒購自 Amersham；重組 IL-1β 轉化酶（ICE）及 ICE 酶底物 Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC為美國 Merck 公司產品。

1.1.6 儀器 Techgene gradient 型 PCR 儀為英國 Techne 公司產品；Victor X5 型微孔板熒光檢測儀為美國 PerkinElmer 公司產品；HP5890 氣相色譜分析儀為美國惠普公司產品；PRISM 377XL 測序儀為美國 ABI 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養 Streptomyces sp.139 及其變株在 28 ℃ 振蕩培養（250 r/min）；乳酸菌Streptococcus thermophilus 在 40 ℃ 以 250 r/min振蕩培養。

1.2.2 DNA 分離和 Southern 雜交 乳酸菌振蕩培養 48 h 后，按 Sambrook 和 Russell［11］所述方法分離總 DNA。鏈霉菌質粒及基因組 DNA 采用Kieser 等［12］提供的方法進行。Southern 雜交根據試劑盒生產商所述步驟進行。

1.2.3 乳酸菌 Streptococcus thermophiles 葡萄糖糖基轉移酶基因 gtf 的克隆 采用 PCR 擴增法，以乳酸菌基因組 DNA 為模板進行。根據已知乳酸菌 Streptococcus thermophilus Sfi6 的糖基轉移酶基因 epsI（GenBank：AAC44016.1）和 epsF （GenBank：AAC44013.1）序列，設計了引物P1-P2，P1：5' GC GAATTCTCTAGAATGGCGTGGC TAATTAA-AATG 3'（橫線部分分別為 EcoR I 和 Xba I 酶切位點），P2：5' GCGAATTCTTAATCGCTT TCAATA 3'（橫線部分為 Sal I 酶切位點）；PCR 擴增條件：94 ℃ 變性 10 min；再行 94 ℃ 變性1 min，47 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸 3 min，循環30 次；72 ℃ 延伸 10 min。擴增獲得的 DNA 片段克隆至 EcoR I 和 Xba I 雙酶切的質粒 pUC18，構建獲得重組質粒 pUC-gtf，經測序證明 DNA 片段為葡萄糖糖基轉移酶基因（gtf）。按分子克隆手冊提供方法將重組質粒 pUC-gtf 轉化至大腸桿菌E.coli DH5α 獲得重組菌 E.coli DH5α（pUC-gtf），并制備重組質粒 pUC-gtf。

1.2.4 構建基因置換株 Streptomyces sp.139 （gtf-22）

1.2.4.1 硫鏈絲菌素抗性基因的克隆 以克隆有硫鏈絲菌素抗性基因的質粒 pGEM-T-tsr 為模板，采用 PCR 擴增方法獲得該抗性基因（tsr）。采用引物 P3-P4，P3：5' GCTCTAGAAGGCGAATACTT CATATG 3'（橫線部分為 Sal I 酶切位點），P4：5' G CGAATTCTCTAGATGATCATCACTGACGAAT 3'（橫線部分為 Hind III 和 Xba I 酶切位點）；PCR擴增條件：94 ℃ 變性 10 min；再行 94 ℃ 變性1 min，58 ℃ 退火 0.5 min；72 ℃ 延伸 2 min；循環 30 次；72 ℃ 延伸 10 min。經 Sal I 及 Hind III酶切驗證后測序與已報道的硫鏈絲菌素抗性基因序列一致。擴增獲得的 1.06 kb 基因片段（tsr）和Sal I-Hind III 酶切的重組質粒 pUC-gtf 連接，進一步經 Xba I 酶切后，從中分離獲得 tsr-gtf 的 DNA片段。

1.2.4.2 乳酸菌葡萄糖糖基轉移酶基因對依博素生物合成基因的置換 采用基因同源重組雙交換方法進行［12］。在以往構建 ste22 基因阻斷菌株Streptomyces sp.139（ste22ˉ）過程中，我們采用了構建的基因阻斷質粒 pKC22［8］，該質粒含有基因 ste22 上游片段 F1（1.1 kb）及下游片段 F2 （1.9 kb）。將 thior-gtf DNA 片段與 Xba I 酶切的pKC22 連接，獲得基因置換質粒 pKC22-gtf，該質粒轉化至缺失甲基化菌株 E.coli ET12567［9］，制備質粒 pKC22-gtf。采用聚乙二醇（PEG）介導的原生質體轉化方法［12］，將質粒 pKC22-gtf 轉化至ste22 基因阻斷菌株 Streptomyces sp.139（ste22ˉ）。轉化平板置于 28 ℃ 培養 16 ～ 20 h，然后覆蓋一層含有硫鏈絲菌素（濃度為 50 μg/ml）的軟瓊脂（瓊脂濃度為 0.6%），轉化平板繼續置于 28 ℃ 培養 2 d，待麻點狀菌落出現后再于 37 ℃ 繼續培養7 d，得到轉化子。將生長出來的菌落同時影印到含有硫鏈絲菌素（50 μg/ml）和安普霉素（40 μg/ml）的 R2 培養基平板上，雙交換突變株轉化子菌落表現為 ThiorAms。在該菌株中，存在于 Streptomyces sp.139（ste22ˉ）染色體的卡那霉素抗性基因 kmr已被乳酸菌來源葡萄糖糖基轉移酶基因 gtf 和硫鏈絲菌素抗性基因 tsr 片段 tsr-gtf 所置換。

隨機挑選若干 ThiorAms菌落，提取Streptomyces sp.139（ste22ˉ）及基因置換株Streptomyces sp.139（gtf-22）的基因組 DNA［12］，并分別以 Kpn I 酶切 DNA 以用于 Southern blot分析。

1.2.5 胞外多糖的分離 依博素產生菌Streptomyces sp.139 及基因置換變株 Streptomyces sp.139（gtf-22）分別在 28 ℃，250 r/min 振蕩培養96 h，按照已建立的分離方法［1］，分別從發酵濾液中分離獲得依博素及其衍生物 EPS-22g。

1.2.6 胞外多糖的單糖分析 多糖 5 mg 用 5 ml （2 mol/L）三氟乙酸溶解，120 ℃ 水解 2 h。水解的糖殘基分別加入 2 ml 氫氧化鈉（0.05 mol/L）和40 ～ 50 mg 的硼氫化鈉，室溫放置過夜，滴入乙酸至無氣泡為止。氮氣吹干后，加入 1 ml 甲醇溶解再用氮氣吹干。反復多次以除去硼酸根，殘渣真空干燥過夜。加入吡啶 0.5 ml，乙酸酐 0.5 ml，在100 ℃ 下保溫 30 min 后，用氮氣除去反應試劑。加入 1 ml 的二氯甲烷溶解，過濾后收集二氯甲烷相，用氮氣吹干后再用二氯甲烷定容。冷卻后樣品進行氣相色譜分析。半乳糖醛酸分析按 Bitter 和Muir［13］報道方法進行。

1.2.7 IL-1β 轉化酶的活性測定 ICE 酶是重要炎癥細胞因子 IL-1β 的生物合成關鍵酶。酶活性測定根據 Koizumi 等［14］報道方法進行。以熒光標記的多肽 Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC 為底物，分別測定了依博素及其衍生物 EPS-22g 對重組 ICE 酶的抑制活性。其反應體系為：1 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）、0.2% 牛血清白蛋白、重組 ICE酶（5 IU）、10 μmol/L ICE 底物 Ac-Tyr-Val-Ala-Asp -AMC 及不同濃度依博素及其衍生物 EPS-22g，總體積 100 μl，37 ℃ 避光反應 2 h，以只加重組酶的樣品為對照，采用多標記微孔板檢測儀在激發光380 nm、發射光 460 nm 條件下測定產物熒光強度。根據樣品及對照的熒光強度值可以計算出對ICE 的抑制率。

1.2.8 巴豆油誘導的小鼠急性炎癥模型 小鼠按體重分為模型組、依博素給藥組及依博素衍生物EPS-22g 3 個實驗組，每組 8 只小鼠。依博素及EPS-22g 分別溶于水，濃度為 100 mg/ml，模型組給水（10 ml/kg），灌胃給藥。小鼠按體重給藥 60 min后，左耳涂 2% 巴豆油液 50 μl。4 h 后處死小鼠，剪下雙耳，用直徑為 8 mm 的不銹鋼銃子沖下左右耳片，分別稱重，以左右耳片重量之差作為腫脹程度，計算對炎癥的抑制率。

樣品組抑制率（%）=（模型組平均腫脹程度 -樣品組平均腫脹程度）/模型組平均腫脹程度 × 100%

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 乳酸菌葡萄糖糖基轉移酶基因 gtf 的克隆

圖1 重組質粒 pUC-gtf 酶切結果的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Figure 1 Agrose gel electrophoresis of pUC-gtf digested with EcoR I-Sal I

以乳酸菌總 DNA 為模板，經 PCR 擴增獲得DNA 片段，瓊脂糖凝膠電泳分析（SDS-PAGE）結果顯示其分子量為 0.94 kb（圖 1）。將該片段克隆至 EcoR I 和 Xba I 雙酶切的質粒 pUC18 構建獲得重組質粒 pUC-gtf，經測序證明與已知乳酸菌Streptococcus thermophilus Sfi6 中葡萄糖糖基轉移酶基因 eps I 一致。

2.2 硫鏈絲菌素抗性基因的克隆

以質粒 pGEM-T-tsr 為模板，利用引物 P3 和P4 擴增硫鏈絲菌素抗性基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增條帶分子量為 1.060 kb，符合預期大?。▓D 2）。PCR 產物經 Sal I-Hind III 酶切后與用相同酶切的質粒 pUC-18 連接，得到重組質粒pUC-tsr，經 Sal I 及 Hind III 酶切驗證后測序，結果與已報道的硫鏈絲菌素抗性基因序列一致。

圖2 重組質粒 pUC- tsr 的瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 2 Agrose gel electrophoresis of pUC-tsr digested with Sal I/Hind III

2.3 異源基因置換株 Streptomyces sp.139 （gtf-22）構建的確認

為了證明 Streptomyces sp.139（ste22ˉ）染色體的卡那霉素抗性基因（kmr）已被乳酸菌來源葡萄糖糖基轉移酶基因（gtf）和硫鏈絲菌素抗性基因（tsr）片段 tsr-gtf 所置換，分別提取異源置換菌株 Streptomyces sp.139（gtf-22）及鏈霉菌Streptomyces sp.139（ste22ˉ）DNA，以 Kpn I 酶切后進行 Southern 雜交實驗。以熒光標記的 ste22基因上游片段 F1 為探針，結果顯示 Streptomyces sp.139（ste22ˉ）DNA 處出現一條 2.35 kb 的陽性雜交信號條帶，而 Streptomyces sp.139（gtf-22）總DNA 處出現一條 3.25 kb 的陽性雜交條帶，結果與預期相同（圖 3B）。實驗結果表明，通過同源重組雙交換，Streptomyces sp.139（ste22ˉ）的卡那霉素抗性基因 kmr確被乳酸菌來源葡萄糖糖基轉移酶基因 gtf 和硫鏈絲菌素抗性基因片段 tsr-gtf 所置換，證明 Streptomyces sp.139（gtf-22）為異源基因置換株。圖 3A 為本研究進行的基因同源重組雙交換示意圖。

2.4 胞外多糖的單糖分析

圖3 ste22 基因的異源置換（A）及 Southern 雜交驗證（B）Figure 3 Heterologous replacement diagram of ste22 gene with a double crossover via homologous （A） and Southern blot analysis （B）

氣相色譜方法分析依博素及其衍生物EPS-22g 的單糖組分，圖 4A，4B 顯示，兩種多糖均由相同種類單糖組成，分別為葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、木糖、鼠李糖。但是EPS-22g 與依博素相比，葡萄糖比例從 2.14% 增至 48.64%，提高顯著，同時 EPS-22g 較依博素其他單糖比例均不同程度降低（圖 4C）。采用 Bitter和 Muir［13］報道方法也證明，兩種胞外多糖均含有半乳糖醛酸。

圖4 氣相色譜分析依博素單糖（A）和 EPS-22g 單糖（B）；依博素和 EPS-22g 單糖組分百分含量示意圖（C）Figure 4 GC chromatograms of sugar analysis of ebosin （A） and EPS-22g （B）； Monosaccharide compositions of ebosin and EPS-22g （C）

2.5 依博素及其衍生物 EPS-22g 對 ICE 酶活性的抑制作用

實驗結果顯示（圖 5），在 100 μl 反應液中，依博素及 EPS-22g 樣品濃度分為 2.5 和 1.25 μg/μl的條件下，對 ICE 酶的活性的抑制率分別為：41.79%、55.3%（P ＜ 0.05）和 9.85%、23.96%（P ＜0.05）。

上述結果表明 EPS-22g 較依博素對 ICE 酶的抑制作用強。鑒于 ICE 酶是重要炎癥細胞因子IL-1β 的生物合成關鍵酶，因此可以說明 EPS-22g比依博素能更有效抑制 IL-1β 的表達水平。

2.6 依博素及其衍生物 EPS-22g 對巴豆油誘導的小鼠急性炎癥抑制作用

圖5 依博素和 EPS-22g 對 ICE 酶的作用（*P ＜ 0.05）Figure 5 Effect of ebosin and EPS-22g on ICE activity （*P ＜0.05）

為了確定依博素及其衍生物 EPS-22g 對巴豆油誘導的小鼠急性炎癥的作用，在巴豆油誘導前1 h，分別對實驗組小鼠灌胃依博素及 EPS-22g 100 mg/kg，和未給藥急性炎癥小鼠對照組比較，EPS-22g 對耳腫脹抑制率為 27.4%（P ＜ 0.05），而依博素抑制率為 18.3%，結果表明，EPS-22g 對巴豆油誘導的小鼠急性炎癥抑制作用略高于依博素（圖 6）。

圖6 100 mg/kg 依博素和 EPS-22g 對巴豆油誘導的急性炎癥小鼠作用（*P ＜ 0.05）Figure 6 Effect of ebosin and EPS-22g on the acute inflamed mice induced by croton oil （*P ＜ 0.05）

3 討論

微生物胞外多糖（EPS）是自然界微生物分泌至細胞表面的多聚物，不同的 EPSs 的重復單元各不相同，包括組成單糖的種類和數量不同，糖苷鍵連接方式的不同［15］。盡管這些 EPSs 表現出很少的共同特性，但由重復單元組成的多糖的生物合成途徑基本相同，均通過糖基轉移酶（GTF）將單糖從核苷酸糖順序性轉移而裝配到脂類載體上形成重復單元，隨后是這些重復單元的聚合和輸出，形成細胞表面多糖［15］。

EPSs 在工業特別是乳制品業中已廣為應用，近年來發現其可能具有藥用前景，例如可增強免疫活性、降低膽固醇、抗糖尿病及抗癌等作用［16-18］，一些 EPS 具有體內抗炎活性［19］，Nowak 等［20］還報道了胞外多糖對類風濕性關節炎（RA）的抑制作用。依博素是一種由鏈霉菌產生的新型胞外多糖，藥效學研究證明其對類風濕性關節炎有較好抑制作用。作用機制研究確定其對 IL-1β 等重要炎癥細胞因子生物合成及信號傳導途徑均有顯著抑制活性［20］，有可能發展成為治療 RA 的新藥。

采用遺傳工程可以改變 EPSs 生物合成，通過定向改變單糖組成和鏈長獲得符合設計的多糖。如對編碼黃原膠側鏈合成的基因進行異源基因置換，獲得了多種黃原膠衍生物，這些衍生物的區別在于側鏈的乙?；⒈峄蚪囟替滈L，與黃原膠相比黏度發生了變化［21］。異源表達糖基轉移酶基因可以在 EPS 生物合成不同階段改變其單糖組成，從而使其性質發生變化，如將新的或已知的糖基轉移酶基因導入乳酸菌可以有效控制新 EPS 衍生物的結構［22-23］。將乳酸菌 EPS 生物合成基因簇轉入胞外多糖非產生菌，在異源宿主菌中已獲得了成功表達［24］。

本課題組以往研究工作確定了依博素生物合成基因簇 ste［4］，已對其生物合成基因性質及編碼產物進行了較多研究。本研究擬采用異源基因置換方法獲得活性較高的新結構依博素衍生物。乳酸菌是重要工業微生物，與鏈霉菌同屬革蘭陽性菌，其EPS 生物合成基因簇已有較多研究［25］。本文以乳酸菌葡萄糖糖基轉移酶基因置換鏈霉菌編碼鼠李糖糖基轉移酶的基因 ste22，經 Southern 雜交證明，成功構建了基因置換菌 Streptomyces sp.139 （gtf-22）。研究結果表明置換株產生了依博素新衍生物 EPS-22g，其單糖組成比例與依博素相比有顯著變化，特別是葡萄糖比例上升突出，從 2.14% 上升至 48.64%，這表明基因置換導致多糖由單糖組成的重復單元序列發生了結構變化。研究結果顯示，EPS-22g 對 ICE 酶活性抑制率高于依博素，由于 ICE 酶是重要炎癥細胞因子 IL-1β 生物合成關鍵酶，因此其對 IL-1β 生成有較強抑制作用。巴豆油誘導的小鼠急性炎癥模型結果顯示，EPS-22g對體內急性炎癥抑制活性高于依博素。

上述結果表明，本研究采用異源基因置換獲得了依博素新衍生物 EPS-22g，其體內外活性初步研究結果顯示均高于依博素，推測葡萄糖比例的顯著升高可能與活性提高相關。鑒于微生物胞外多糖結構復雜，因此有關依博素結構與生物活性的相關性尚需進行深入研究。根據本文初步結果可以推測，異源基因置換依博素生物合成基因可能是獲得高活性多糖衍生物的一種重要途徑。

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Methods Gene ste22 has previously been demonstrated to code for a rhamnosyltransferase. With PCR amplification， a gene encoding glucosyltransferase was isolated from Streptococcus thermophilus. Using a double crossover via homologous recombination， the gene ste22 in Streptomyces sp.139 was replaced by the gene encoding glucsyltransferase originated from Streptococcus thermophilus. With the assay of IL-1β-converting enzyme （ICE） and acute inflamed mice model induced by croton oil，primary results of activity for novel ebosin derivative produced by the heterologous gene replacement strain was identified.

Results The heterologous gene replacement strain Streptomyces sp.139 （gtf-22） was constructed， which produced a novel ebosin derivative EPS-22g. This alteration resulted in EPS-22g with its monosaccharide composition dramatically changed， especially in the proportion of glucose， which increased from 2.14% （ebosin） to 48.64% （EPS-22g）. Comparing with ebosin， EPS-22g exhibited a higher inhibitory effect on the activity of IL-1β-converting enzyme （ICE）. Experiments with acute inflamed mice induced by crotonoil showed higher anti-inflammatory activity of EPS-22g than that of ebosin.

Conclusion To generate derivatives of ebosin for better activity， the strategy of ebosin biosynthesis gene replaced by heterologous gene may be more useful.

Study of ebosin biosynthesis gene ste22 replaced by heterologous gene

GUO Lian-hong， ZHANG Yang， BAO Yong-gang， BAI Li-ping， JIANG Rong， LI Yuan

Objective Ebosin is a novel exopolysaccharide produced by Streptomyces and evidenced to possess an anti-rheumatic arthritis activity. The ebosin biosynthesis gene cluster has been identified. Here， we aim to generate derivatives of ebosin for better activity，and replace ebosin biosynthesis gene ste22 by heterologous gene.

Heterologous gene replacement； Gene gtf； Gene ste22； Streptomyces； Streptococcus thermophilus

LI Yuan， Email： yuanwli@263.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.007

國家自然科學基金重點項目（30530830）；“重大新藥創制”國家科技重大項目（2009ZX09301-003）

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所衛生部抗生素生物工程重點實驗室

李元，Email：yuanwli@263.net

2015-02-06

*同為第一作者

結果 獲得了葡萄糖糖基轉移酶基因置換株 Streptomyces sp.139（gtf-22），產生了依博素新衍生物 EPS-22g。研究表明該衍生物與依博素相比，葡萄糖比例從 2.14% 顯著上升到 48.64%，體外活性實驗顯示，其對炎癥細胞因子白細胞介素-1 合成關鍵酶 ICE 抑制率高于依博素，小鼠巴豆油急性炎癥體內活性分析結果證明，該衍生物抑制活性亦高于依博素。

結論 采用異源基因置換生物合成基因的方法改造依博素產生菌，可能是獲得生物活性較好新多糖衍生物的一種有效手段。

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術， 2015， 10（3）：228-235

Author Affiliation： Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics of Ministry of Health， Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol， 2015， 10（3）：228-235