水稻抗稻瘟菌HIGS表達載體的構建及遺傳轉化

王夢穎, 劉 敬, 瞿紹洪, 王旭麗*, 王國梁*

(1.中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;2. 浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所, 杭州 310021)

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水稻抗稻瘟菌HIGS表達載體的構建及遺傳轉化

王夢穎1, 劉 敬1, 瞿紹洪2, 王旭麗1*, 王國梁1*

(1.中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;2. 浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所, 杭州 310021)

水稻是我國主要糧食作物之一,而稻瘟病是影響水稻安全生產的最主要病害之一。為克服抗病基因的抗病性很快消失的弊端,本研究嘗試了宿主誘導的基因沉默(HIGS)技術在創制抗稻瘟病水稻新材料上的可行性。HIGS是新發展起來的以RNAi為基礎的抗病技術,即在寄主植物中表達可沉默病原物特定基因的HIGS載體,達到控制病原菌擴展的目的。本研究選取了兩個稻瘟菌致病關鍵基因Nox1和NAC為研究靶標,分別克隆其UTR區和CDS區中的特異區段,利用Gateway技術構建這4個片段HIGS表達載體,再利用農桿菌介導法將各載體分別轉化水稻,通過鑒定得到轉基因陽性植株,為后續開展該技術在水稻抗稻瘟病方面的深入研究奠定了基礎。

水稻; 稻瘟病; HIGS; 遺傳轉化

水稻是世界上種植最廣泛的農作物之一,養育了全世界超過1/2的人口[1]。隨著人口的增長及人們生活水平的提高,水稻產量需要在2030年提高40%方可滿足水稻供需平衡[2]。目前的水稻產量遠遠難以滿足消費需求,這要求我們培育出更優質、高產、穩產的水稻品種來克服由生物或非生物因素造成的損失。在諸多生物因素中,稻瘟病是影響水稻高產最嚴重的威脅之一[3-4]。稻瘟病由稻梨孢菌(Magnaporthegrisea)引起,每年因該病害損失的糧食可以養活六千萬人口,造成經濟損失超過700億美元[5]。因此,稻瘟病的防控成為水稻生產中的重要課題。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的一種基因調控手段,其通過siRNA或microRNA介導,抑制靶標基因的表達。近年來基因沉默機制的相關研究為探索病原真菌與宿主的互作以及新型控病策略提供了新的思路。RNAi機制已經被用來商業化創制對病毒有抗性的轉基因植株[6]。HIGS(host-induced gene silencing)是新發展起來的基于RNAi的抗病技術,通過在寄主植物中表達以病原真菌特定基因為靶標的RNAi載體，特異性地沉默該病原真菌中靶標基因的表達[7]。對布氏白粉菌[Blumeriagraminis(DC.) Speer][8]、條形柄銹菌(PucciniastriiformisWest)[9]、輪枝鐮孢菌[Fusariumverticillioides(Sacc.) Nirenberg][10]等的相關研究已經證明了利用HIGS機制來創制轉基因抗病植株的可行性。在大麥或小麥中導入以布氏白粉菌致病相關基因為靶標的dsRNA或者反義RNA,可使轉基因植株對白粉菌具有抗性,當通過HIGS機制沉默效應子Avra10的表達,在缺失相應的抗病基因Mla10的情況下,病原菌的正常生長受到抑制。在擬南芥或大麥中導入以輪枝鐮孢菌基因CYP51為靶標的dsRNA,大大提高了轉基因植株對輪枝鐮孢菌的抗性。在針對條形柄銹菌的HIGS研究中發現,當沉默基因PtMAPK1、PtCYC1、PtCNB的表達時,寄主對病原菌的抗性增強,病原菌的生長及產孢都受到了抑制[8-10]。以上研究結果表明,宿主誘導的基因沉默有潛力作為一種新型植物保護措施,用于培育持久抗病的作物新品系。

雖然在多個病原真菌-宿主互作體系中已經證實了HIGS的作用,但尚無研究報道HIGS是否對水稻抗稻瘟病有效。本研究選取了2個稻瘟菌致病關鍵基因Nox1和NAC進行HIGS的相關研究。Nox1和NAC基因存在于稻瘟菌中,Nox1編碼NADPH氧化酶,是稻瘟菌附著胞正常形成并完成侵染的關鍵基因,該基因缺失會導致稻瘟菌致病性喪失[11]。NAC編碼ATP合成酶,是植物病原真菌致病關鍵因子(本研究團隊擬發表數據)。本研究分別克隆這2個基因的UTR區及CDS區中的特異片段,利用Gateway技術構建這4個片段HIGS表達載體,并采用農桿菌介導法將其轉入水稻獲得轉基因陽性植株,為水稻抗稻瘟病分子育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNA提取所用稻瘟菌菌株70-15、轉化用水稻品種‘日本晴’種子、克隆用宿主菌E.coliDH5α均為本實驗室保存。載體pENTR和pBDL03由浙江省農業科學院惠贈。大腸桿菌(E.coli) DH5α感受態以及農桿菌EHA105感受態細胞為本實驗室制備。TRIzol、GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒購自Invitrogen公司,限制性內切酶(BamHI、XhoI、KpnI、SacI)、TaqDNA聚合酶、dNTPs及T4DNA連接酶購自Fermentas公司,RNA反轉錄試劑盒、DNA回收純化試劑盒、各種抗生素(潮霉素、卡那霉素、利福平)購自Promega公司,其他試劑為國產分析純級。引物合成及測序由北京華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNAi干擾區段的選擇與引物設計

選擇稻瘟菌中2個致病關鍵基因Nox1(MGG_00750)和NAC(MGG_02660)來進行HIGS研究。Nox1調節NADPH的形成[11],NAC編碼ATP合成酶。根據在稻瘟菌數據庫中公布的這2個基因的基因組DNA序列及CDS序列,通過在稻瘟菌數據庫(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome.html)及水稻數據庫(http:∥rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中進行BLAST比對分析,分別在這2個基因的UTR區及CDS區選取大約350 bp的特異區段作為RNAi干擾區段(注意所選取的RNAi干擾區段必須是特異性的,干擾這段區域不會對其他基因的表達造成影響)。采用Primer 5.0設計4個干擾區段的引物,并在上游引物5′端添加BamHI酶切位點及保護堿基,在下游引物5′端添加XhoI酶切位點及保護堿基。所選取的RNAi干擾區段不含BamHI、XhoI、KpnI、SacI酶切位點(表1)。

1.2.2 RNA提取與目標干擾片段的獲得

采用TRIzol法提取稻瘟菌70-15菌株的總RNA,使用RNA反轉錄試劑盒獲得cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增。采用25 μL的PCR反應體系,包含0.5 μL的反轉錄cDNA,10 μmol/L的上下游引物各1 μL,1U的TaqDNA聚合酶,1×PCR緩沖液,2 μL dNTPs。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證其條帶大小正確后回收并檢測產物濃度。

表1 PCR擴增所用引物1)

1) 小寫序列為所添加的限制性內切酶BamHI和XhoI的酶切位點。

The lowercase letters indicate the restriction enzyme sites ofBamHI andXhoI.

1.2.3 HIGS表達載體的構建

1.2.3.1 入門載體的構建

pENTR載體為入門載體,該載體的多克隆位點含BamHI和XhoI酶切位點,PCR獲得的RNAi干擾片段兩端也具有這2個酶切位點。pENTR空載體質粒及純化后的PCR產物均由限制性內切酶BamHI和XhoI雙酶切,對酶切并純化后的pENTR空載體和RNAi干擾片段使用T4連接酶在22 ℃孵育2 h，從而將靶標基因的特異RNAi干擾片段連到入門載體中。

將酶連產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,轉化后菌液涂布于含卡那霉素的LB固體平板上。37 ℃孵育10～14 h。

從平板上挑取單克隆搖培,提取菌液質粒并使用限制性內切酶BamHI和XhoI雙酶切鑒定，以pENTR空載體雙酶切作為對照。陽性載體送華大基因測序,測序正確即成功構建入門載體。

1.2.3.2 表達載體的構建

pBDL03為HIGS表達載體(圖1)。構建成功的入門載體pENTR在RNAi干擾片段的兩端含有2個重組位點attL1和attL2,HIGS表達載體pBDL03中含有attR1和attR2重組位點。將構建成功的入門載體和HIGS空表達載體pBDL03利用Gateway技術進行LR重組反應,入門載體的重組位點會與HIGS表達載體的重組位點發生同源重組,入門載體中的RNAi干擾序列將替換掉HIGS表達載體中attR1和attR2重組位點間的序列,實現將外源RNAi干擾片段構建到HIGS表達載體的目的。

使用GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒進行LR重組反應構建表達載體。5 μL的反應體系中包含：入門載體50～150 ng,pBDL03空載體(與入門載體的摩爾比需接近1∶1),TE緩沖液(pH 8.0),1 μL LR enzyme mix。輕輕混合,25 ℃過夜反應。

加入0.5 μL蛋白酶K終止反應。37 ℃孵育10 min,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,取菌液涂布于含卡那霉素的LB固體平板上。37 ℃孵育10～24 h,從平板上挑取單克隆搖培,提取菌液質粒并用KpnI、SacI雙酶切鑒定(pBDL03載體中含這2個酶切位點),以pBDL03空載體雙酶切作為對照。鑒定為陽性的載體送華大基因測序,測序正確即完成了HIGS表達載體的構建。

1.2.4 HIGS表達載體轉化農桿菌及農桿菌介導法轉化水稻

采用電轉法將4個HIGS表達載體轉化至農桿菌EHA105感受態細胞,將菌液涂布于含卡那霉素和利福平的LB固體篩選平板上,28 ℃培養2～3 d。從平板上挑取單克隆進行KpnI、SacI雙酶切鑒定。鑒定正確的菌株用于水稻轉化。

圖1 HIGS表達載體pBDL03圖譜Fig.1 The map of HIGS expression vector pBDL03

參考Hiei等[12]的方法進行水稻轉化。將水稻成熟的胚愈傷組織與含HIGS表達載體的農桿菌共培養,然后經含潮霉素的篩選培養基篩選2次得到抗性愈傷組織, 分化、再生得到轉基因水稻株系。

1.2.5 轉基因植株的篩選及PCR檢測

因HIGS表達載體中含有潮霉素磷酸轉移酶標記基因(hpt)及mCherry紅色熒光蛋白標記基因,所以對得到的4個HIGS表達載體的轉基因植株進行潮霉素抗性鑒定及紅色熒光觀察,可初步篩選出轉基因陽性植株。

剪取轉基因植株的綠色健康葉片浸泡于含潮霉素(100 μg/mL)和6-芐氨基嘌呤(1 μg/mL)的檢測液中,26 ℃，L∥D=12 h∥12 h下培養,5～7 d后觀察葉片顏色的變化,判斷植株對潮霉素的抗性水平[13]。

使用熒光蛋白觀察儀,戴上裝有熒光濾光片的觀察帽,在黑暗環境下用紅色熒光激發光源對準轉基因植株的莖稈和葉片,觀察mCherry紅色熒光蛋白。

通過以上方法初步篩選出轉基因陽性植株,選取其中部分植株,采用CTAB法提取水稻植株的基因組DNA,以基因組DNA稀釋液為模板,使用擴增RNAi干擾片段的引物進行轉基因植株的PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 目標干擾片段的獲得

以稻瘟菌菌株70-15總RNA反轉錄得到的cDNA為模板,用設計的4對引物進行PCR擴增,分別獲得Nox1基因的5′UTR區和CDS區、NAC基因的3′UTR區和CDS區中特異片段,大小依次為342、368、329和359 bp。

2.2 入門載體的構建及其鑒定

RNAi干擾片段與pENTR入門空載體經酶切、連接、轉化大腸桿菌感受態后,由卡那霉素篩選得到入門克隆,挑取單菌落搖菌,提取質粒后通過限制性內切酶BamHI和XhoI雙酶切鑒定。成功構建的載體在經限制性內切酶BamHI和XhoI雙酶切后凝膠電泳可分離出大小分別為2 700 bp和350 bp左右的電泳條帶,結果顯示,4個RNAi干擾片段均成功導入入門載體(圖2)。

圖2 入門載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of the entry vectors by restriction enzyme digestion

2.3 HIGS表達載體的構建及其鑒定

構建正確的重組質粒經雙酶切后電泳分離可分別獲得10 kb和2 kb左右的電泳條帶。結果顯示,各重組質粒均構建成功。酶切鑒定正確的質粒送華大基因公司測序,測序正確的質粒用于轉化農桿菌。

2.4 HIGS表達載體轉化農桿菌及農桿菌介導法轉化水稻

將成功構建的HIGS表達載體轉化農桿菌EHA105后,篩選得到目的克隆。采用農桿菌介導法將HIGS表達載體轉入水稻中,每個HIGS表達載體均獲得轉基因水稻T0代植株。

2.5 轉基因植株的篩選及PCR檢測

4個HIGS表達載體的T1代轉基因植株通過潮霉素抗性檢測(圖3)和mCherry紅色熒光觀察初步鑒定轉基因陽性植株。

圖3 轉基因水稻植株的潮霉素抗性檢測結果Fig.3 The hygromycin resistance test of the transgenic plants

提取各載體T1代轉基因植株的基因組DNA,使用目標干擾片段的引物鑒定。結果顯示野生型植株的基因組DNA PCR擴增后電泳未出現任何條帶,而陽性植株的基因組DNA經PCR擴增后,出現了約350 bp左右的電泳條帶,表明HIGS載體上的外源基因片段存在于該水稻植株中(圖4)。

圖4 轉基因水稻植株的PCR檢測Fig.4 PCR detection of transgenic rice plants

HIGS表達載體轉化的轉基因植株TransgenicplantstransformedbyHIGSconstructspBDL03-Nox1-UipBDL03-Nox1-MipBDL03-NAC-UipBDL03-NAC-Mi總株數Numberoftransgenicplants46314442潮霉素抗性植株Hygromycin+31203827帶mCherry紅色熒光基因植株mCherry+28203830基因組PCR檢測為陽性植株GenomicDNAPCR+29223735經3種方法鑒定均為陽性的植株Positivetransgenicplantsidentifiedthrough3methods28193727

表2中展示了通過以上3種方法鑒定出的轉基因陽性植株,結果發現3種方法的鑒定結果一致性較好,選取3種方法鑒定結果均為陽性的植株進行擴繁并做進一步的抗病分析,選取3種方法鑒定結果均為陰性的植株作為后續試驗的對照。

3 討論

本研究利用了傳統的酶切和連接方法,結合Gateway位點特異性重組技術,構建了分別以稻瘟菌致病關鍵基因Nox1和NAC為靶標的HIGS表達載體。這種載體構建方法簡單快捷,僅需兩步亞克隆,即可使外源片段快速構建到HIGS表達載體中。我們所選擇的HIGS表達載體含有由Gus linker連接的2個反向attR位點,重組反應后RNAi干擾片段整合到重組位點之間,由Gus linker連接2個反向的RNAi干擾序列,產生發卡結構,形成dsRNA并由dsRNA引發下一步的RNAi反應。另外HIGS表達空載體的每個attR位點之間含有ccdB致死基因,如果重組反應不成功則轉化菌不能存活,該機制保證了LR反應后得到的表達載體的準確性。值得一提的是,在進行LR反應構建HIGS表達載體的過程中,我們發現注意以下幾點可提高構建效率。第一,為降低成本,可將10 μL的反應體系減半為5 μL的反應體系。第二,使用新鮮的入門載體質粒及HIGS表達空載體質粒有助于提高重組效率,另外要保證質粒濃度較大,LR反應時HIGS表達空載體與入門載體的摩爾比為1∶1時重組效率高。第三,加入GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix酶后將反應液置于25 ℃過夜反應可提高重組率。

本研究將構建好的4個HIGS表達載體通過農桿菌介導的遺傳轉化法轉化水稻獲得轉基因植株。因為我們所使用的HIGS表達載體是在pANDA載體的基礎上改造而成的,改造后的HIGS載體在具有潮霉素磷酸轉移酶標記基因,卡那霉素抗性基因的基礎上,連接進了mCherry基因。因此在對轉基因陽性植株的篩選過程中,不僅可以利用對潮霉素的抗性初步篩選陽性轉基因植株,也可以通過使用熒光觀察儀來初步篩選轉基因陽性植株,因為成功轉入HIGS表達載體的植株會表達mCherry紅色熒光蛋白,從而更加便利了轉基因陽性植株的篩選。結果證明潮霉素抗性鑒定、mCherry紅色熒光蛋白鑒定和提取植株基因組DNA進行PCR檢測鑒定3種方法一致性較好,證明了這3種鑒定方法均具有可行性。通過3種方法鑒定結論均為陽性的植株其HIGS表達載體成功轉入的可靠性更高。并且潮霉素抗性鑒定及mCherry紅色熒光蛋白觀察鑒定這兩種方法操作簡便,成本較低,可為大規模篩選鑒定轉基因陽性植株節省時間、人力、物力。

本研究構建了HIGS表達載體并成功轉化水稻得到了轉基因陽性植株,為下一步的轉基因植株的抗病性鑒定奠定了基礎。本研究獲得的轉基因植株同傳統的轉基因植株不同,被導入寄主植物的是以病原菌致病相關基因為靶標的dsRNA。當病原菌侵入寄主植物時,這些dsRNA具有引發RNAi作用的潛力,可沉默病原菌中的靶基因表達,影響病原菌的繼續侵染,達到提高轉基因植物對該病原菌的抗性的目的。雖然HIGS現象已經被證明在作物抗布氏白粉菌、條形柄銹菌、輪枝鐮孢菌侵染危害中發揮作用,但是HIGS是否對水稻抗稻瘟菌有作用還未見報道。這是在水稻中轉入稻瘟菌致病相關基因干擾片段進行HIGS研究的首次嘗試,具有重要的理論意義與實際應用價值。

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(責任編輯：楊明麗)

Construction of rice blast resistant HIGS expression vectors for rice genetic transformation

Wang Mengying1, Liu Jing1, Qu Shaohong2, Wang Xuli1, Wang Guoliang1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021,China)

Rice blast disease seriously influences the quality and production of rice, the main food crop in China. To overcome the easy breakdown of conventional disease resistant transgenic plants, we used HIGS (host induced gene silencing) to create new kind of transgenic rice plants. By transforming HIGS constructs targeting the virulence-related genes of the rice blast fungusMagnaporthegriseainto host plants, HIGS could suppress the fungal development and virulence. We chose two important genes inM.oryzaeand cloned the specific fragments of the genes for HIGS vector construction. Then we transformed the HIGS constructs into rice. This research lays the foundation for molecular breeding of rice blast resistant varieties.

rice; rice blast; HIGS (host induced gene silencing); genetic transformation

2014-04-06

2014-07-25

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2012ZX08009001)；國家自然科學基金青年基金(31101404)

Q 782

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.015

實驗方法與技術ExperimentalMethod&Technology

* 通信作者 E-mail:lilywang0313@163.com；wang.620@osu.edu