小麥矮縮病毒NASH快速檢測方法的建立及應用

金 文, 張金良, 劉 艷*, 王錫鋒

(1.中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193; 2.北京市植物保護站,北京 100029)

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小麥矮縮病毒NASH快速檢測方法的建立及應用

金 文1, 張金良2, 劉 艷1*, 王錫鋒1

(1.中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193; 2.北京市植物保護站,北京 100029)

以非放射性物質地高辛為標記物,采用PCR法制備了特異性強、靈敏度高的DNA探針。通過優化反應體系, 建立了小麥矮縮病毒(Wheatdwarfvirus, WDV)的核酸斑點雜交 (nucleic acid spot hybridization,NASH)快速檢測技術體系。該方法診斷準確率高,操作簡單,周期短,整個檢測過程僅需5 h左右。利用建立的NASH技術開展WDV流行學調查,發現近年來WDV在我國陜西韓城、山西太原和河北石家莊等地區點片發生,沒有大面積暴發成災。

小麥矮縮病毒; 地高辛; 核酸斑點雜交(NASH); 快速檢測

小麥矮縮病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)是一類侵染麥類作物的雙生病毒,為雙生病毒科(Geminiviridae)玉米線條病毒屬(Mastrevirus)的成員[1-2]。該病毒由條沙葉蟬(PsammotettixstriatusL.)以持久性非增殖方式傳播[3],寄主為小麥、大麥、燕麥和多種禾本科雜草,罹病植株表現為矮化、黃化、分蘗增多等[4],它的局部流行曾對歐洲多個國家的大麥、小麥生產造成很大危害[5-7]。2007年我國首次報道了小麥矮縮病毒在山西太原發生[8],隨后在陜西、甘肅、河北和云南等12個省均有發現。近年來在陜西北部麥區已引起嚴重減產,正成為威脅我國西北、華北和西南麥區重要的病毒病[9-11]。建立適合田間大量樣品鑒定的快速檢測方法,做到早期發現與預警,對及時有效地控制該病害將起到重要的作用。

植物病毒的檢測方法通常有生物學、血清學和分子生物學等手段。但就小麥矮縮病毒而言,由于該病毒為蟲傳病毒,其傳播介體條沙葉蟬飼養困難,生物學鑒定難度很大;血清學具有快速簡便、高通量等優點,但對制備抗體的特異性有較高要求;PCR法較為常用,但存在因交叉污染而帶來的假陽性等問題。核酸斑點雜交技術(nucleic acid spot hybridization,NASH)具有特異性強、靈敏度高等特點[12],尤其是非放射性標記如地高辛的發展使得這種方法得到更廣泛的應用[13],近年來NASH技術已廣泛應用于植物病毒的檢測中[14-15]。本研究制備了基于地高辛標記的DNA探針,將NASH檢測技術用于小麥矮縮病毒(WDV)的快速診斷和鑒定。

1 材料與方法

1.1 毒源及傳毒介體

小麥矮縮病毒(WDV)分離物和傳毒介體(條沙葉蟬)均采自陜西韓城小麥矮縮病毒病發病田塊。經 PCR檢測和基因測序確定為小麥矮縮病毒(WDV)后,在感病小麥品種(‘揚麥12’)上繁殖毒源。條沙葉蟬經脫毒純化后在健康小麥上扣罩飼養。上述毒源和介體均在22 ℃,20 000 lx條件的光照培養箱中常年繁殖。小麥黃矮病毒GPV株系(Wheatyellowdwarfvirus-GPV, WYDV-GPV)及大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus, BYDV)的GAV株系和PAV株系等參照毒源均為本實驗室-70 ℃保存樣品。

1.2 探針引物的設計、合成與標記

將GenBank上登錄的WDV陜西韓城分離物與其他地區分離物進行序列比對,結果表明外殼蛋白(coat protein, CP)基因較為保守,故選取該基因作為靶基因。應用Vector NT 10.0軟件設計CP基因特異性引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體序列為CP/F: 5′-ATGGTGACCAACAAGGACTCC-3′;CP/R:5′-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3′。DIG探針標記采用PCR法,用試劑盒(DIG PCR probe synthesis kit,Roche)中的DIG-dNTPs(含0.7 mmol/L DIG-11-dUTP,1.3 mmol/L dTTP)代替PCR正常體系中的dNTPs進行PCR擴增。

1.3 WDV-CP基因的克隆

PCR擴增反應體系為：模板DNA 1 μL,10 μmol/L正反向引物各0.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,5U ExTaq酶0.25 μL,10×buffer 2.5 μL,加ddH2O至25 μL。在Eppendorf PCR儀中按下列擴增程序進行：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,56 ℃復性45 s;72 ℃延伸1 min,35次循環;最后72 ℃ 延伸10 min,4 ℃下保存備用。將純化好的PCR產物連接至pMD-18T載體(TaKaRa)上,轉化到DH 5α大腸桿菌感受態中。經PCR鑒定選取3個陽性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成序列測定。

1.4 WDV-NASH檢測方法的建立

采用CTAB法提取樣品的總DNA：取1 μL點于尼龍膜(Amersham HybondTM-N+,GE Healthcare)上,將膜放在UV紫外交聯儀中固定;將固定好的雜交膜放入雜交袋中,加入適量雜交緩沖液后50 ℃下預雜交15 min;將DIG探針100 ℃變性5 min后加入雜交液中,50 ℃雜交1.5～2 h;膜置于足量的2×SSC(含0.1% SDS)溶液中,振蕩漂洗2次,每次10 min;轉入足量的0.5×SSC (含0.1% SDS)的溶液中,65 ℃條件下輕微振蕩漂洗2次,每次10 min;用封閉緩沖液輕搖封閉20 min。

采用免疫顯色：加入堿性磷酸酶標記的DIG抗體(Roche公司)達到工作濃度為1∶7 500,室溫孵育30 min;洗滌液(0.1 mol/L maleic acid,0.15 mol/L NaCl, pH 7.5,含0.3% W/V Tween-20)洗膜2次,每次10 min;加入適量含330 μg/mL NBT和165 μg/mL BCIP的堿性磷酸酯酶緩沖液(現用現配);暗處顯色約20～30 min,用50 mL無菌雙蒸水或TE buffer 將膜漂洗5 min,終止顯色反應。

1.5 NASH特異性和靈敏度檢測

取1 μL小麥矮縮病毒DNA提取液,同時以健康小麥DNA提取液和感染小麥的其他病毒WYDV-GPV、BYDV-GAV和BYDV-PAV的cDNA作為對照,按照建立的NASH檢測方法進行特異性檢測;將小麥矮縮病毒DNA模板進行10倍系列梯度稀釋,得到10-1～10-6倍的稀釋液,進行靈敏度檢測試驗。

1.6 大田疑似WDV樣品的檢測

2010年至2013年間,于每年小麥生長季在我國主要麥區采集嚴重矮化、分蘗增多、黃化且不能抽穗的小麥矮縮病毒疑似標樣。每份標樣稱取0.1 g,采用CTAB法提取樣品的總DNA,溶解于0.1×TE 溶液中,-20 ℃暫存備用。采用1.4中建立的WDV-NASH技術進行檢測。

2 結果與分析

2.1 WDV-CP基因的克隆

從繁殖WDV毒源的小麥葉片中提取總DNA,采用1.2中設計的特異性引物對(CP/F和CP/R)擴增獲得了大小約為780 bp的條帶(圖1泳道1), 與預期CP基因目的片段大小(783 bp)基本一致。將回收純化的CP基因擴增產物與載體pMD-18T連接,并轉化至大腸桿菌中,經PCR鑒定和序列測定獲得含WDV-CP基因的重組質粒。

2.2 地高辛標記探針的制備

以獲得的含WDV-CP基因的重組質粒為模板,采用DIG標記PCR法制備探針。反應結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳,因DIG的分子量大,從圖中可以看出已標記的條帶(圖1泳道2)明顯滯后于普通未標記的條帶,說明此探針標記成功。

圖1 PCR法制備WDV特異性DIG探針的電泳圖Fig.1 Gel analysis of PCR-amplified specific DIG-labeled probe for WDV

2.3 探針特異性檢測

將已提取的WDV、WYDV-GPV、BYDV-GAV和BYDV-PAV等病毒核酸各取1 μL點于同一張尼龍膜上,以健康小麥DNA作為陰性對照,用制備的WDV特異的DIG核酸探針進行核酸斑點雜交。結果顯示：該探針僅與WDV樣品DNA產生反應(圖2)。表明此探針具有較強的特異性,可以用于鑒別區分WDV和與其癥狀相似的小麥上其他病毒。

圖2 WDV-CP探針的特異性檢測Fig.2 Detection for the specificity of WDV-CP probe

2.4 探針靈敏度檢測

提取3份WDV樣品DNA,編號為1～3。用Nanodrop微量測定儀測定核酸濃度,1～3號樣品的濃度分別為1 501.4、904.7和1 647.7 ng/μL。分別取1 μL DNA,按10-1～10-6系列比例用ddH2O稀釋DNA,然后按稀釋順序點于同一張尼龍膜上進行斑點雜交。雜交顯色結果(圖3)表明10-2稀釋倍數能得到較為清晰的DNA印跡,10-3稀釋倍數仍能檢測到DNA,該試驗3次重復的平均靈敏度為1.33 ng/μL。

圖3 WDV-CP探針的靈敏度檢測Fig.3 Detection for the sensitivity of WDV-CP probe

2.5 大田疑似樣品的檢測

采用建立的WDV-NASH技術,對2010年至2013年采自山西、陜西、山東、河北、云南和四川等12個省份部分地區的373份WDV疑似標樣進行了檢測。取標樣DNA 1 μL點于尼龍膜上,并分別以已知WDV毒源樣品和樣品緩沖液為陽性對照和空白對照，部分雜交結果見圖4。結果表明近幾年來小麥矮縮病毒在陜西韓城、山西太原和河北石家莊等地區點片發生,沒有大面積暴發。將檢測樣品同時用PCR方法驗證,準確率達99%以上。

圖4 部分大田標樣的核酸斑點雜交檢測結果Fig.4 Detection of samples collected from fields by NASH assay

3 討論

WDV一旦發生,其造成的經濟損失就會相當嚴重,所以各發生國家都十分重視對該病害的流行監測。依賴于抗血清的WDV檢測技術以ELISA技術最成熟,應用最廣泛。但由于受到抗血清制備水平的限制,國內尚無商品化的抗血清;以分子生物學技術為基礎,已經開發出如qPCR[16]和RCA-RAPD[17]等針對WDV的檢測技術,但是這些技術不易掌握,且受到試劑和儀器昂貴等成本問題影響,難以在基層植保部門推廣。

本研究首先對WDV病毒及其近似種的核苷酸序列進行系統分析,設計了用于特異性檢測WDV的CP基因特異性引物,并對反應條件進行了優化,建立了以地高辛標記的DNA探針為基礎的NASH檢測技術。免疫檢測結果表明：制備的含WDV-CP的DNA探針具有較強的特異性和高靈敏度,并成功地應用于田間疑似WDV標樣的檢測。該探針的制備方法簡單,具有無放射性污染的優點,且可反復使用4～5次,節約了檢測成本。將制備的地高辛探針、雜交緩沖液和洗滌液等反應體系成分組裝成試劑盒后,無需PCR、酶聯測定儀等任何昂貴的儀器,操作簡單方便,對基層單位十分適用,具有良好的應用前景。

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(責任編輯：楊明麗)

Development and application of nucleic acid spot hybridization (NASH) assay for rapid detection ofWheatdwarfvirus

Jin Wen1, Zhang Jinliang2, Liu Yan1, Wang Xifeng1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Beijing Plant Protection Station, Beijing 100029, China)

In this study, a nucleic acid spot hybridization (NASH) method was developed to detectWheatdwarfvirus(WDV). Based on digoxigenin (non-radioactive)-labeled strategy, a DNA probe with well-characterized specificity and sensitivity was prepared by PCR.The reaction system was optimized for highly accurate diagnosis and simple operation. The whole process of assay was rapid and efficient, which could be completed in 5 h. The established system was applied to epidemiological survey of WDV.The results indicated that no large-scale outburst of WDV has occurred in China in recent years, and it only happened sporadically in local areas, including Hancheng (Shaanxi Province), Taiyuan (Shanxi Province) and Shijiazhuang (Hebei Province).

Wheatdwarfvirus(WDV); digoxigenin; nucleic acid spot hybridization (NASH); rapid detection

2014-04-16

2014-07-21

國家自然科學基金(31171820)；北京市糧食高產創建項目(PXM2013-036203-000022);糧食作物產業技術體系北京市創新團隊項目

S 435.121.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.019

* 通信作者 E-mail:yliu@ippcaas.cn