球孢白僵菌菌絲生長中HsbA基因的表達量變化

張 燁, 雷仲仁, 王海鴻

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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球孢白僵菌菌絲生長中HsbA基因的表達量變化

張 燁, 雷仲仁*, 王海鴻

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

球孢白僵菌是一種具有殺蟲潛力的生防真菌,菌絲是其重要的結構單位,而疏水蛋白被認為參與了氣生菌絲的生長過程。本文以球孢白僵菌疏水表面結合蛋白編碼基因HsbA為檢測對象,利用熒光定量PCR方法研究了該基因在液生菌絲和氣生菌絲中的相對表達量，結果表明，HsbA基因在氣生菌絲中的相對表達量顯著高于液生菌絲。基于以上結果,我們推斷,HsbA基因在氣生環境下的上調表達可能會增加其編碼蛋白的總量,從而對球孢白僵菌氣生菌絲的生長發育起到調控作用。研究結果不僅為菌種的遺傳改良提供了一個切入點,也對菌株的商業化生產有一定的指導意義。

球孢白僵菌;HsbA基因; 菌絲; 氣生生長; 熒光定量PCR

球孢白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.) Vuill.]是一類廣譜性昆蟲病原真菌[1-3],已被廣泛應用于多種農林害蟲的生物防治[4-5]。菌絲體是球孢白僵菌重要的侵染結構和營養結構,它可以通過頂端伸長,以及在近頂端產生分支結構的方式在寄主體表或者營養基質中生長。而疏水蛋白被認為參與了氣生菌絲的形成過程[6-7]。

疏水蛋白廣泛存在于絲狀真菌中,它們的單體結構能通過分子間疏水吸引力在不同物相之間作出反應,因而具有自動組裝的能力[8]。基于這一生物學特性,該蛋白也時常被認為是一類具有表面活性的小分子物質,并在菌絲的發育過程中執行了一系列功能。首先,疏水蛋白有助于菌絲突破液-氣界面[9-11]。當水面張力達到72 mJ/m2時,會阻礙氣生菌絲的發育,但疏水蛋白可以通過形成膜狀結構降低液體表面張力,從而有助于菌絲的氣生生長;其次,當氣生菌絲形成后,疏水蛋白能夠在其表面形成短桿狀結構層,既賦予了氣生菌絲疏水特性,又保證了其他氣生結構不至于喪失水分[12]。此外,疏水蛋白還可以通過自身的表達來調節菌絲進行氣生生長的時期。當在營養液或者營養基質中培養時,水壓會抑制疏水蛋白基因的表達,使得菌絲以基內生長為主,作為氣生生長所需養料和水分的一個運輸通道[6]。

目前,國內外常選用液固雙相法來培養絲狀真菌,并以此獲得具有侵染能力的氣生分生孢子[13]。而在絲狀真菌的整個生活史中,基內菌絲的形成以及氣生菌絲的發育至關重要,它直接影響著孢子絲的分化及孢子的產生。前人的研究肯定了疏水蛋白在菌絲生長中所起的積極作用,但對于該類蛋白的分子表達機制尚不明確。因此,本文借助熒光定量PCR方法,研究了球孢白僵菌疏水表面結合蛋白(hydrophobic surface binding protein)編碼基因HsbA在基內菌絲和氣生菌絲中的相對表達量,從轉錄水平闡述該蛋白編碼基因的表達模式,以期為揭示該蛋白在菌絲生長中所行使的功能提供一些佐證,并為菌株的遺傳改良提供一些理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

RNA快速提取試劑盒購自Aidlab公司;DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒購自Axygen公司;Transcription Reverse System試劑盒購自Promega公司;SYBR Premix ExTaq試劑盒購自TaKaRa公司;其他常規化學試劑由植物病蟲害國家重點試驗室提供。PCR儀購自Biometra公司;熒光定量PCR iCycler IQ購自Bio-Rad公司;DYY-6C型電泳儀和DYCP-31DN型電泳槽購自北京六一廠;Biodoc-It 220型凝膠成像系統購自美國UVP公司。

1.1.2 菌株和載體

球孢白僵菌強毒株SZ-26由本實驗室從田間感病寄主上分離并篩選后保存,大腸桿菌DH5α菌株和克隆載體pBM19-T均購自Biomed公司。

1.1.3 培養基

Czapek培養基(固體培養基需另加入15 g瓊脂)：NaNO33 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO40.5 g,FeSO40.01 g,蔗糖30 g,加蒸餾水定容到1 L,滅菌。

1.2 培養方法

1.2.1 液體培養

將球孢白僵菌菌株SZ-26的分生孢子均勻分散于0.05% Tween-80溶液中,并等量接種到Czapek培養液中,于26 ℃、120 r/min下振蕩培養,分別于3、5、7和9 d取樣。培養物以真空抽濾,獲得液培菌絲,液氮中凍存備用。

1.2.2 固體培養

將球孢白僵菌菌株SZ-26的分生孢子均勻分散于0.05% Tween-80溶液中,等量接種到Czapek平板并用涂布器使其分布均勻,于26 ℃下靜置培養,分別于3、5、7和9 d取樣。收集氣生菌絲,液氮中凍存備用。

1.3 分析方法

1.3.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

將各處理樣本于液氮中充分研磨成細粉狀,參照RNA快速提取試劑盒說明書進行球孢白僵菌總RNA的提取,電泳檢測。利用DNaseⅠ除去DNA并測定消化后RNA樣本的濃度及純度,利用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.3.2 熒光定量PCR分析HsbA基因的相對表達量

質粒標樣的構建：利用ExTaq聚合酶對反轉錄模板進行PCR反應,根據已獲得的HsbA基因全長設計目的基因引物[14],并參照Cho等所選擇的內參基因進行熒光引物合成[15]。目的基因HsbA正向引物：5′-CTCGTCGGTCCGTCCAAC-3′,反向引物：5′-GGCGTCAGTCACTCCCGT-3′;內參基因β-tubulin正向引物：5′-TCCTTCGTACGGTGACCTGA-3′,反向引物：5′-CGAGCTTGCGAAGATCAGAG-3′。擴增條件如下：95 ℃,1 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;72 ℃,5 min。分別將目的基因和內參基因擴增產物進行電泳回收,并克隆到載體pBM19-T中進行測序。回收測序正確的單克隆質粒作為質粒標樣,對其進行濃度和純度測定。

qRT-PCR反應：將質粒標樣做連續10倍稀釋,得到6個濃度梯度用于標準曲線的繪制。同一反應板包括質粒標樣(內參或者目的基因)及對應的處理樣本。反應條件如下：95 ℃,3 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,80個循環,每循環退火溫度增加0.5 ℃。

相對表達量的計算:用標準曲線相對定量法分析目的基因的相對表達量，所用方法同Pfaffl[16]。試驗結果用歸一化值表示，HsbA基因表達量歸一化值=HsbA基因濃度/β-tubulin基因濃度。以液生菌絲HsbA基因在第3天時的表達量為基準，利用公式：HsbA基因相對表達量=待測樣品HsbA基因表達量歸一化值/液生菌絲HsbA基因在第3天時的表達量歸一化值，計算待測樣品HsbA基因的相對表達量值，其中，液生菌絲HsbA基因在第3天時的相對表達量值即為1。

1.3.3 數據分析

每個樣本設置3次生物學重復,每個生物學重復包含3次技術重復,每個反應板設置相應的空白對照。所有的數據經預處理后,由數據統計軟件SPSS V16.0進行單因素方差分析,顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

利用熒光實時定量PCR法分別測定球孢白僵菌內參基因β-tubulin和目的基因HsbA不同濃度下的Ct值,并繪制標準曲線,得到線性方程y=-3.218x+41.697(R2>0.99)和y=-3.237x+40.035(R2>0.99),且β-tubulin和HsbA基因的擴增效率E分別為104.7%和103.7%(圖1～2)。

圖1 球孢白僵菌內參基因β-tubulin標準曲線Fig.1 Standard curve of β-tubulin gene in Beauveria bassiana

圖2 球孢白僵菌目的基因HsbA標準曲線Fig.2 Standard curve of HsbA gene in Beauveria bassiana

2.2 HsbA基因在菌絲生長中的相對表達量分析

將同一培養時間下液生菌絲和氣生菌絲中HsbA基因的相對表達量進行t-檢驗,統計結果表明,在3、5、7和9 d時,HsbA基因在氣生菌絲中的相對表達量均顯著高于液生菌絲(t=-5.56,df=4,P<0.01;t=-28.771,df=4,P<0.01;t=-12.486,df=4,P<0.01;t=-6.758,df=4,P<0.01),且在第7天時,該基因的相對表達量達到最大(圖3)。

圖3 HsbA基因在不同培養時間下的相對表達量 Fig.3 Relative abundance of HsbA under different incubation times

3 討論

內參基因的選擇、引物的設計和反應體系的優化是影響熒光定量PCR反應的幾個關鍵性因素。本試驗選擇的β-tubulin基因為常見的內參基因[17],其在不同菌絲類型中均能穩定表達。此外,基于閾值循環數和起始模板濃度對數所繪制的標準曲線具有較高的擬合度,且目的基因和內參基因的擴增效率理想。因此,本試驗所選用的引物和反應條件適于熒光定量PCR反應,結果具有一定的可信度。

對氣生菌絲和液生菌絲不同時期HsbA基因的相對表達量進行分析,結果表明,氣生菌絲中該基因的相對表達量在同一時期均顯著高于液生菌絲。這主要是因為,相對于液生菌絲,氣生菌絲的生長發育需要克服一系列的生存障礙[18]。首先,培養基質和空氣之間的表面張力會阻礙菌絲的氣生生長;其次,菌絲在空氣中會遭受到干燥缺水的威脅[19-20]。因此,當氣生菌絲生長時,會通過HsbA基因的上調表達產生抵抗逆境的蛋白產物,從而起到保護作用。該結論已經在裂褶菌[Schizophyllumcommune(Fr.)]中的SC3蛋白和SC4蛋白[7]、雙孢蘑菇[Agaricusbisporus(Lang.)]中的ABH3蛋白[11]、榆枯萎病菌[Ophiostomaulmi(Buisman)和O.novo-ulmi(Brasier)]中的CU蛋白[21-22]、唐德鏈霉菌(Streptomycestendae)的表面活性蛋白streptofactin[23]、天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)中的短肽類物質SapB[24]中得到證實,一些其他的疏水類蛋白也表現出類似的功能[25-26]。據此可推斷,在球孢白僵菌氣生菌絲的生長發育過程中,HsbA基因可能通過自身的上調表達來增加其編碼蛋白總量,從而對該過程起到一定的調控作用。

隨著球孢白僵菌制劑的產業化推進,人們愈發關注菌種在批量生產中的得率,并采取了一系列優化措施。傳統的優化手段集中在培養條件的控制上,通常只是通過改變生長環境被動地去迎合菌體的生長,而對與菌種生長發育相關功能基因的研究則可以讓我們適度改造菌株,使其具有新的優良性狀,去主動適應環境。本研究發現了HsbA基因在球孢白僵菌氣生菌絲生長發育中的積極作用,這不僅為菌株的生長發育研究提供了理論基礎,也為工程菌株的改造提供了一些切入點,使我們可以從分子水平“趨利避害”,使菌種的生產效率最大化,對菌種的規模生產具有重要的現實意義。

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(責任編輯：楊明麗)

Dynamics ofBeauveriabassianaHsbAgene expression levels in hyphal growth

Zhang Ye, Lei Zhongren, Wang Haihong

(State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193, China)

Beauveriabassianais an important entomogenous fungus which has the potential for pest control. Mycelia are the major structural unit ofB.bassiana, and hydrophobins are considered to participate in the process of aerial hyphae. In the present study, relative expression abundance ofB.bassianaHsbA(hydrophobic surface binding protein) gene in aerial hyphae and substrate mycelia were analyzed by using qRT-PCR.The results showed that the expression level ofHsbAgene in aerial hyphae was significantly higher than that in substrate mycelia. Based on the above results, we concluded that up-regulated expression ofHsbAgene might increase the amount of protein encoded, which could regulate the development of aerial hyphae inB.bassiana. This conclusion provided not only an approach to strain improvement, but also a guide for commercial production of this fungus.

Beauveriabassiana;HsbAgene; hypha; growth in the air; qRT-PCR

2014-06-08

2014-07-09

國家現代農業科技城產業培育項目(Z121100001212006)；現代農業產業技術體系(CARS-25-B-07)

Q 965

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.025

* 通信作者 E-mail: leizhr@sina.com