西藏小型豬MSTN基因分子克隆及序列分析

吳清洪，岳 敏，田雨光，2，王玉玨，徐名襯，顧為望，2

(1．南方醫科大學實驗動物中心比較醫學研究所，廣州 510515;2．東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司，廣東東莞 523808)

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)又稱GDF- β(growth differentiation factor β)，是生長轉化因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族的新成員［1－4］。MSTN 在骨骼肌中特異性表達，對肌肉生長有負調控作用，研究表明，該基因的突變在肉牛中會造成骨骼肌異常肥大［5］。通過抑制MSTN活性而增加肌肉量，在豬的分子育種具有潛在的應用價值。因此，該基因被發現后短短幾年之內很多物種的MSTN基因得到克隆、測序和定位［6－8］。

喬憲鳳等［9］在2010年就以湖北白豬背最長肌肌細胞總RNA為模版，利用RT-PCR技術，擴增出湖北白豬的MSTN基因的cDNA片段，其測序結果與報道的一致。西藏小型豬是2004年南方醫科大學實驗動物中心從西藏工布江達縣引入純種的45頭西藏小型豬，作為實驗動物進行封閉群管理［10］。目前已完成風土馴化及實驗動物化研究，并開展了相關動物模型、藥物實驗及轉基因克隆等研究。從免疫學、遺傳學研究發現，該品系具有獨特的免疫相關指標和遺傳特征，加上其獨特的外形，是一種優良的實驗用小型豬品種［11－13］。研究西藏小型豬的MSTN基因，可為進一步開展西藏小型豬分子育種技術研究等提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:西藏小型豬6月齡1頭，來源于南方醫科大學實驗動物中心【SCXK(粵)2011-0074】，取其肝臟，液氮速凍，－80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(No．DP419)、質粒小提試劑盒(No．DP103)、DH5α 感受態細胞(No．CB101)購自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScript RT reagent Kit(No．DRR037A)、EX Taq(No．DR001A)、pMD19-T Vector(No．D102A)、HindIII內切酶、EcoRI內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自廣東省東盛生物科技有限公司;DM2000購自北京康為世紀生物科技有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

使用天根公司的RNA提取試劑盒提取肝臟組織的總RNA。組織從－80℃冰箱中取出來，用液氮冷卻研磨成粉末，倒入去RNA酶的1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，反復吹打室溫靜置5 min，按照試劑盒說明按步驟提取。利用核酸蛋白濃度測定儀Nano Drop 2000測RNA濃度及純度(OD260/OD280)，余下樣品－20℃保存。

1.2.2 cDNA合成

使用寶生物公司的PrimeScript RT reagent Kit進行逆轉錄反應。cDNA合成按下列組份配制RT反應液(反應液配制在冰上進行)。5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL，Oligo Dt Primer(50 μmol/L)1 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL，Total RNA 1 μg，RNase Free dH2O加至20 μL。反轉錄反應條件為:37℃ 15 min(反轉錄反應)，85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)。－20℃保存備用。

1.2.3 PCR引物的設計和合成

根據GenBank中豬MSTN基因的序列(Gene Accession No．:NM_214435)，運用引物設計軟件Primer5.0設計特異性引物，由Invitrogen公司合成。引物為:Up(P1):5’-ATGCAAAAACTGCAAATCTA TGTTTATATTTAC-3’，Down(P2):5’-TCATGAGCA CCCACAGCGATCTAC-3’

1.2.4 PCR擴增

在PCR反應管中配置25 μL的反應體系，模板量為0.5 μL豬cDNA擴增MSTN。25 μL的反應體系為 2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL，10 × Ex Taq buffer 2.5 μL，模板 cDNA 0.5 μL，引物 P1 2.5 μL，引物 P2 2.5 μL，ExTaq 0.3 μL，ddH2O 14.6 μL。擴增條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，32個循環;72℃ 5 min;16℃保存。

1.2.5 PCR產物的回收純化

PCR產物經1%瓊脂糖電泳后，在紫外條件下，手術刀切取含目的片段的凝膠條帶至干凈1.5 mLEP管中，利用廣東東盛生物科技有限公司的DNA凝膠回收試劑盒純化目的片段，純化產物中一部分直接測序，一部分進行克隆測序。

1.2.6 目的片段與載體連接

將純化的目的片段與pMD19-T載體進行連接，反應體系 10 μL:1 μL pMD19-T Vetor，2 μL 回收的PCR 產物，5 μL SolutionI，2 μL ddH2O。恒溫循環水浴16℃連接2 h。

1.2.7 連接產物的轉化、復蘇和培養

冰浴中將6 μL連接產物加入至30 μLDH5α感受態細胞中，混勻，冰浴30 min，42℃水浴熱休克90 s，再冰浴 2 min。分別加入 200 μL LB 培養基(Amp－)，混勻，37℃、200 r/min 振蕩培養 1 h，將菌液涂布與含氨芐青霉素(Amp+100 μg/mL)的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉移至37℃生化培養箱中，正置培養1 h后，倒置過夜培養。

1.2.8 質粒的酶切鑒定陽性克隆

從平板上面各接種若干菌落于3 mL LB液體培養基(Amp+)的15 mL離心管中200 r/min，37℃搖床過夜培養。使用天根的質粒小提試劑盒提取質粒，進行酶切鑒定，反應體系為10 μL:4 μL的提取質粒，10 × M Buffer 1 μL，HindIII 0.4 μL、EcoRI0.4 μL。37℃酶切2 h。酶切產物以含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統成像。陽性菌液送金唯智基因公司測序。

2 結果

2.1 RT-PCR結果

從西藏小型豬肝臟組織中提取總RNA，逆轉錄后，以cDNA為模板，以特異性引物擴增到了1152 bp長的片段，與預期相符(圖1)。

圖1 RT-PCR擴增結果Fig．1 The electrophoresis of RT-PCR amplification

2.2 重組質粒酶切電泳結果

將西藏小型豬的RT-PCR產物經純化回收后，插入到pMD19-T載體的外源基因插入位點，構建重組質粒，重組質粒經HindIII內切酶、EcoRI內切酶雙酶切(圖2)。

圖2 重組質粒和酶切鑒定圖Fig．2 Identification of recombinant plasmid by digested(HindIII+EcoRI)and plasmid

2.3 西藏小型豬MSTN基因序列分析和比對

利用DNAman、Lasergene等多個生物信息學軟件由西藏小型豬MSTN cDNA序列可以獲得編碼的375氨基酸(圖 3)。與 NCBI網站(http://www．ncbi．nlm．nih．gov)BLAST 后 下 載 的 人(NM005259.2)、小 鼠 (NM010834)、大 鼠(NM019151)、山 羊 (HM462261)、黑 猩 猩(NM001079919)、 牛 (GQ184147)、 綿 羊(NM001009428.1)、犬(NM001002959)、版納微型豬 (JN630464)、 馬 (NM001081817)、 雞(NM001001461)11個物種的氨基酸序列進行比對，相似性分別為95%、92%、91%、95%、95%、94%、94% 、93% 、99% 、97% 、85% 。

圖3 西藏小型豬MSTN基因推導蛋白氨基酸序列Fig．3 The putative amino acid sequence of MSTN gene of Tibet mini-pigs

2.4 西藏小型豬MSTN進化樹

利用Mega6.0軟件將西藏小型豬的MSTN氨基酸序列與人、小鼠、大鼠、山羊、黑猩猩、牛、綿羊、犬、版納微型豬、馬、雞、斑馬魚12個物種的MSTN氨基酸序列構建進化樹(圖4)。結果顯示，西藏小型豬MSTN基因除了與雞和斑馬魚親緣關系較遠外，與其他10個物種較為接近，其中與版納微型豬的親緣關系最為接近。

圖4 MSTN分子系統進化樹Fig．4 The phylogenetic tree of MSTN protein

3 討論

1997年，McPherron等通過篩選小鼠的骨骼肌cDNA文庫而得到全長的cDNA序列。分析表明，小鼠Myostatin cDNA序列中只有一個開放閱讀框架(opening reading frame，ORF)，編碼 376個氨基酸，具有TGF-β超家族的典型結構，但與其它TGF-β家族成員的同源性很低，因而被為新一類:GDF-8(growth-differentiation factor 8)。研究表明，GDF-8前肽C-末端區域對其功能的穩定性具有重要的作用，抑制性區域位于氨基酸42～115之間［14－16］。國外Lee及其同事Daneau等［17］都報道了豬肌生成抑制素基因的cDNA序列，綜合兩者的結果，已得到1756 bp的豬肌生成抑制素cDNA序列，其中1～1125 bp編碼氨基酸序列，表明豬肌生成抑制素前體由375個氨基酸組成。本研究通過對西藏小型豬的MSTN基因的cDNA序列進行了克隆測序，發現MSTN基因編碼區全長 1128 bp，利用 DNAman、Lasergene等多個生物信息學軟件由西藏小型豬MSTN cDNA序列可以獲得編碼的375氨基酸。與版納微型豬進行比對分析發現在307位的氨基酸由N→S。

在與人、小鼠、大鼠、山羊、黑猩猩、牛、綿羊、犬、版納微型豬、馬、雞11個物種的氨基酸序列進行比對，相似性分別為 95%、92%、91%、95%、95%、94%、94%、93%、99%、97%、85%，發現西藏小型豬與版納微型豬的相似性最高，達99%。與人、山羊、黑猩猩、馬相應序列同源性都超過了94%。表明西藏小型豬與11個物種間在該基因編碼區核苷酸序列間具有較高的保守性。

分子系統進化樹表明MSTN基因西藏小型豬除了與雞和斑馬魚親緣關系較遠外，與人、犬、版納微型豬、綿羊、山羊、牛、馬、黑猩猩、大鼠、小鼠的關系都較為接近，其中與版納微型豬的親緣關系最為接近，這也更進一步說明了西藏小型豬與版納微型豬是親緣關系較近的兩個豬種，只是在該基因核苷酸和氨基酸水平上有很小差異，說明了西藏小型豬與版納小型豬起源及進化程度有所不同，它們在DNA水平上有極小的差異，這也為進一步開展西藏小型豬分子育種技術研究等提供了理論依據。

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