石榴皮多酚對痤瘡丙酸桿菌體外抑菌活性的研究

張曉玲，朱明芳*，楊 柳，胡 彬，謝 遙

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

痤瘡是一種多種因素引起的常見的毛囊、皮脂腺慢性炎癥性疾病，目前研究認(rèn)為，痤瘡的發(fā)病機(jī)制主要與雄激素、皮脂分泌增多、毛囊口上皮角化亢進(jìn)、痤瘡丙酸桿菌增殖及遺傳等因素有關(guān)[1]。 而痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acne, P. acnes）在痤瘡的發(fā)病中扮演著重要的角色，是痤瘡發(fā)病的重要病原菌之一，也是外用藥物治療痤瘡的重要靶點(diǎn)[2]。因而，尋找抑制P.acnes 生長的藥物，成為治療痤瘡的一個重要研究方向。 目前主要的外用藥物包括抗生素和維生素A 酸類，前者存在易產(chǎn)生抗生素耐藥等嚴(yán)重問題，后者則有刺激性和潛在的致畸危險等不足，因此探索安全性好、不易耐藥的外用抗痤瘡藥物較為迫切[3]。

石榴皮為石榴科植物石榴的干燥果皮。 其性酸、溫、澀，具有澀腸、止血、收斂止瀉以及殺蟲等功效[4]。 石榴皮的主要生物活性成分為石榴皮多酚，主要包括鞣花單寧、沒食子單寧、鞣花酸和沒食子酸等多種化合物, 具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗突變、降血壓和潤膚美容之功效[5]，而在臨床實(shí)踐中，也證實(shí)石榴皮對霍亂弧菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌、溶血性鏈球菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、結(jié)核桿菌及多種皮膚真菌都有抑制作用[6-7]。

石榴皮多酚對痤瘡的作用研究目前尚未見報道，我們將通過觀察石榴皮多酚在體外P. acnes 是否存在抑制作用，為開發(fā)新型外用痤瘡治療藥物奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

石榴皮多酚醇提物（購自陜西慧科科技公司，石榴皮多酚含量為70%)；甲硝唑純品(購于長沙麗欣有限公司，純度為99.9%) 。

1.2 菌株

P. acnes 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC11827 （廣東微生物菌種保藏中心提供）。

1.3 主要實(shí)驗儀器

PL202-S 精密電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LDZX-30KB 立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；GNP-9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；麥?zhǔn)媳葷峁埽ū本┱艹煽萍加邢薰荆?/p>

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基按庖肉培養(yǎng)基說明進(jìn)行常規(guī)配制，調(diào)pH值為7.1～7.2， 將配制好的培養(yǎng)基于錐形瓶中密封好后，放入滅菌鍋中于121 ℃下滅菌30 min，待冷卻后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌懸液的制備

標(biāo)準(zhǔn)菌株活化后接種于平板培養(yǎng)基上進(jìn)行增菌培養(yǎng)（用厭氧袋封裝，37 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h）后用無菌生理鹽水沖洗，將菌懸液用無菌生理鹽水稀釋后，調(diào)整為0.5個麥?zhǔn)媳葷釂挝唬s為1.5×108CFU/mL），備用。

2.3 藥物溶液制備

2.3.1 受試藥石榴皮多酚溶液配制 取石榴皮多酚醇提物，用滅菌后的無菌蒸餾水首先從1:1 開始讓粉末溶解， 配置成500、300、100 mg/mL 3 種濃度的溶液，備用。

2.3.2 對照藥品溶液的制備 按NCCLS 公布的對厭氧菌判斷敏感標(biāo)準(zhǔn)[8]，精確稱取甲硝唑1.0 mg，用DMSO 溶解，最終配制為16 μg/mL 的溶液。

2.4 抑菌活性測定

2.4.1 生長抑制試驗——牛津杯法 制備固體培養(yǎng)基，待預(yù)熱培養(yǎng)基溫度降至45 ℃時，于每個平板加入20 mL，在無菌操作條件下，吸取上述菌懸液（約為1.5×108CFU/mL）100 μL，用涂布棒均勻涂抹在冷卻凝固的培養(yǎng)基上。再用無菌鑷將牛津杯輕放在培養(yǎng)基表面，輕壓牛津杯使接觸良好。 分別取3個不同濃度的石榴皮多酚水溶液200 μL 加入牛津杯中， 于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72 h 后取出，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量各培養(yǎng)皿中供試液有效抑菌圈的直徑(mm)，計算平均值。各濃度重復(fù)4 次，另外配置對照組：空白對照組（培養(yǎng)基）、陽性對照組（菌懸液、培養(yǎng)基、甲硝唑），觀察細(xì)菌的生長情況、培養(yǎng)基和石榴皮多酚對細(xì)菌生長的影響。 抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＜6 mm 為耐藥；抑菌圈直徑在6～10 mm 為輕度敏感； 抑菌圈直徑在10～14 mm 為中度敏感；抑菌圈直徑在15～20 mm 為高度敏感；抑菌圈直徑＞20 mm 為極度敏感[9]。

2.4.2 最小抑菌濃度(MIC)測定——藥基瓊脂稀釋法 用無菌移液槍分別吸取1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mL 500 mg/mL 的石榴皮多酚水溶液，分別注入到10 mL 無菌試管中，再依次加入4、4.2、4.4、4.6、4.8、4.9、4.95 mL 無菌培養(yǎng)基（溫度＜45 ℃），充分混勻后冷卻制成含藥液固體斜面，即最終藥液濃度分別 為100、80、60、40、20、10、5 mg/mL；吸取菌懸液（1.5×108CFU/v） 0.1 mL 由上而下流滿斜面，并以培養(yǎng)基和純藥液管作陽性和陰性對照。 于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)72 h 后，觀察P. acnes 的生長情況。以上步驟重復(fù)3 次，從各管中找出完全沒有菌生長的最低稀釋液濃度的實(shí)驗管，作為MIC。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料用“±s”表示，各小組組間差異顯著性判斷采用方差分析，組間比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 牛津杯法的抑菌結(jié)果

生長抑制實(shí)驗牛津杯結(jié)果提示，石榴皮多酚醇提物和陽性對照藥對P. acnes 均有抗菌活性，且抑菌圈直徑都大于l0 mm， 敏感性較強(qiáng)， 其中500 mg/mL 的抑菌圈的直徑大于20 mm， 為極度敏 感，300、100 mg/mL 的 抑 菌 圈 的 直 徑 在15 ～20 mm，為高度敏感，陽性對照藥甲硝唑的抑菌圈直徑在10～14 mm，為中度敏感。 陽性對照組與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而3 種濃度的石榴皮多酚醇提物與空白對照組比較，差異顯著（P＜0.01）， 與陽性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。 由抑菌圈的直徑比較可知，石榴皮多酚醇提物對P. acnes 的抑菌作用較強(qiáng)， 有一定的臨床意義，而作為陽性對照的甲硝唑，其抑菌作用較預(yù)期弱，值得進(jìn)一步研究。 結(jié)果見表1、圖1、圖2。

表1 不同濃度石榴皮多酚醇提物對P. acnes 體外抑菌實(shí)驗結(jié)果 （±s，mm,n=4）

表1 不同濃度石榴皮多酚醇提物對P. acnes 體外抑菌實(shí)驗結(jié)果 （±s，mm,n=4）

注：△代表石榴皮多酚醇提物；與空白組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

藥物500 mg/mL△300 mg/mL△100 mg/mL△甲硝唑空白組抑菌圈直徑25.90±1.28**20.70±1.05**17.78±1.12**12.50±0.93*0

3.2 藥基瓊脂稀釋法的抑菌結(jié)果測定

從圖3、 圖4 中可看出P. acnes 只在陽性和10 mg/mL、5 mg/mL 加藥試管中長出菌落,余試管中都未長有P. acnes 菌落，可知其MIC 為20 mg/mL。見表2。

表2 石榴皮多酚醇提物對P. acnes 的MIC（mg/mL，n=3）

圖1 牛津杯法（培養(yǎng)前）

圖2 牛津杯法（37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h 后）

圖3 藥基瓊脂稀釋法（培養(yǎng)前）

圖4 藥基瓊脂稀釋法（37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h 后）

從左到右的順序，試管中石榴皮多酚醇提物的濃度依次為100、80、60、40、20、10、5 mg/mL。

4 討論

目前痤瘡的治療主要從心理、藥物和物理治療三方面出發(fā)，而抑制痤瘡發(fā)病相關(guān)菌——痤瘡丙酸桿菌的生長增殖則是從源頭開始的治療手段。 本實(shí)驗采用了牛津杯法，因該方法具有易操作、低成本的特點(diǎn)，實(shí)驗結(jié)果也易于判讀和比較。 在平板中，越靠近牛津杯，藥物濃度越大，反之則越小，直到藥物的濃度無法抑制其菌種生長時才長出菌落，形成以牛津杯為中心的抑菌圈，但是此方法無法測出藥物的MIC。 近幾年來， 我國最常用的體外藥物敏感試驗測量藥物對菌種MIC 的方法是美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所制定的方案，但其方案是根據(jù)藥物對菌種生長抑制的混濁度或是運(yùn)用比色法進(jìn)行MIC 終點(diǎn)判讀的。而中藥的MIC 終點(diǎn)判讀困難是因提取物本身具有一定的顏色所造成。 因此，通過比較，最后本實(shí)驗采用具有簡便經(jīng)濟(jì)且易于操作的藥基瓊脂稀釋的方法測量MIC，這種方法準(zhǔn)確直觀，結(jié)果判讀精確，易于比較。

本實(shí)驗結(jié)果表明，石榴皮多酚醇提物在體外具有明確的抑制痤瘡丙酸桿菌活性的作用。 但本次實(shí)驗僅進(jìn)行了石榴皮多酚醇提物體外敏感試驗的研究，尚缺乏臨床驗證，其作用機(jī)理與臨床應(yīng)用效果的進(jìn)一步研究暫時缺乏，而藥物在人體皮膚上的作用機(jī)制比體外敏感試驗相對復(fù)雜，臨床上石榴皮多酚作用于人體皮膚時能否達(dá)到與體外相同的效果，還有待進(jìn)一步觀察與驗證。 因此，在體外抑菌實(shí)驗的基礎(chǔ)上，我們需要進(jìn)一步開展動物實(shí)驗，如此才能篩選出真正安全有效的中藥。

[1]李賢俏,楊金生. 痤瘡的病因病機(jī)和外治法研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2013,19(6):713-716.

[2]Kircik LH. Re-evaluating treatment targets in acne vulgaris：adapting to a new understanding of pathophysiology [J]. J Drugs Dermatol，2014，13(6)：S57-S60.

[3]Coates P，Vyakrnam S，Eady EA，et al. Prevalence of antibiotic-resistant propionibacteria on the skin of acne patients：10-year surveillance data and snapshot distribution study [J]. Br J Dermatol，2002，146(5)：840-848.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：93.

[5]Sreekumar S, Sithul H, Muraleedharan P, et al. Pomegranate fruit as a rich source of biologically active compounds. Biomed Res Int, 2014，（2014）：1-12.

[6]楊筱靜， 趙波， 那可， 等. 石榴皮中多酚類物的的研究進(jìn)展，2013，44（5）：509-514.

[7]何宇.石榴皮提取物抑菌活性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(35)：17 306-17 307，17 372.

[8]胡繼紅，高振祥，尹銘芳.簡介美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會最新推薦厭氧菌藥敏實(shí)難方法及評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2002，25（3）：183-184.

[9]戴自英.臨床抗菌藥物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：219-223.