眩暈定顆粒對后循環缺血性眩暈家兔Bcl-2，Bax及BDNF表達的影響

肖 瑤，彭逢春，王凈凈*，劉春華，左亞杰，何 群，何英櫻，袁斯思

（1.湖南省人民醫院，湖南 長沙410005；2.湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院，湖南 株洲412000；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；4.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙410006；5.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007； 6.湖南郴州市中醫院，湖南 郴州423000）

眩暈是指感覺自身或環境的旋轉、擺動，是一種運動幻覺，在以眩暈/頭暈為主訴的患者中，存在后循環缺血(posterior circulation ischemia，PCI)的比例可達59.89%[1-2]。神經細胞凋亡是腦缺血損傷的重要病理機制。 Bcl-2、Bax 基因是目前研究較明確的一對在功能上相互對立的凋亡調控基因，其表達蛋白對神經元凋亡具有調控作用。 腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)能維持神經系統的正常發育，阻止腦細胞凋亡。 臨床實踐證明，“眩暈定方” 能有效改善眩暈患者的臨床癥狀[3]。“眩暈定顆粒” 是將導師王凈凈教授多年臨床經驗總結的自擬方“眩暈定方”，經過水提，超臨界二氧化碳(SFE-CO2)萃取丹參、當歸、川芎等5 味中藥材，制成的純中藥顆粒。 筆者以腦干前庭神經核相關因子作為觀測指標，研究“眩暈定顆粒”對氣虛血瘀型后循環缺血性眩暈家兔模型的影響，以期探討該藥的作用機制，為眩暈定方中藥新藥開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年新西蘭白兔70 只 （由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供， 動物合格證號：SCXK（湘）2010-0011，雌雄各半，清潔級，體質量（2.0±0.3）kg，兔齡3～4個月，室溫10～20 ℃，濕度65～70%，除正常組自由飲水進食外，其余家兔自由進水、控制進食+高脂飼料喂食。

1.1.2 高脂飼料 高脂飼料（每100 g 高脂飼料中含有膽固醇1 g，蛋黃粉15 g，豬油5 g 和普通飼料79 g）， 由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供和制作；膽固醇，購自長沙麗欣生物（CAS 號：57-88-5）；蛋黃粉， 亳州市眾意蛋業有限責任公司 （批號：20100726）；豬油，自制。

1.1.3 受試藥物 眩暈定顆粒：由黃芪、當歸尾、黨參、川芎、牡丹皮、地龍、葛根、丹參等11 味藥組成，以上中藥材均購自于安徽海鑫中藥飲片有限公司，經過SFE-CO2提取、 水煎煮回流提取以及濃縮、純化、干燥后得到顆粒制劑（由湖南中醫藥大學藥學院與第一附屬醫院藥劑科完成），每袋6 g（相當于生藥材86 g）[4]；眩暈定方濃縮液：藥物組成同顆粒制劑， 藥材浸泡后， 水煎煮2 次， 每次煎得藥液200 mL，合并藥液，濃縮至125 mL，每毫升含生藥1 g；西比靈膠囊：5 mg/粒（西安楊森制藥有限公司，批號：20100203）；眩暈寧片：0.38 g/片，（桂林三金生物藥業有限責任公司，批號：20100504）。

1.1.4 主要藥物 消痔靈注射液（吉林集安制藥集團，批號：20100416）；利多卡因注射液（上海朝暉藥業有限公司，批號：20100618）。 消痔靈注射液與利多卡因按1∶1 的比例混合配成造模用硬化劑注射液。

1.1.5 試劑及儀器 SABC 試劑盒（SA1022，Lot NO.06A10BJ）、BDNF 試劑盒 （BA4053）、Bcl-2 試劑盒（BA0412）、Bax 試劑盒（BA0315），均購自武漢博士德生物工程有限公司；LEICA DM LB2 型雙目顯微鏡（德國LEICA 公司）；Shandon 325 型石蠟切片機（英國Shandon 公司）；自制“可調速眩暈產生儀”(由湖南航空航天機械加工廠制作)，在其直流調速電機前加一個調速器，使旋轉速度0～150 r/min 自由可調，通過機械離心力誘發家兔產生眩暈癥狀，在電機上連一個圓形金屬盒用來固定家兔，大小(直徑×高)：35 cm×35 cm；自制“逃避刺激反射訓練箱”(由湖南航空航天機械加工廠制作)， 大小為70 cm×65 cm×65 cm，底板為金屬板，通電后可因導電而產生疼痛刺激， 在籠內安裝1個25 cm 的高臺， 其面積為6 cm×30 cm 大小，供家兔逃避疼痛刺激而設。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 參照血管性眩暈動物模型制作方法[5]，選取清潔級健康成年新西蘭大白兔70 只，體質量（2.0±0.3）kg，雌雄各半。 隨機抽取其中8 只作為正常組，予以普通飼料80 g/（kg·d），每天分2次喂給，不作任何干預；其余62 只采用饑餓+高脂飼料+旋轉+頸椎旁注射硬化劑復合方法造模。 高脂干預， 即所有造模家兔予以高脂飼料10 g/(kg·d)喂養，時限為實驗全過程；饑餓干預，即在高脂飼料喂養之外，僅給予普通飼料15 g/(kg·d)同時一次投予，時限同高脂飼料；硬化劑注射，先予以頸椎旁注射硬化劑(記為實驗開始第1 天)，1 周后重復1 次，以后隔周重復1 次，6 周注射結束，共注射4 次；在第4 次硬化劑注射之前，即實驗第39～41 天，使用逃避刺激反射訓練箱對正常組及造模家兔進行逃避刺激反射訓練，以胡蘿卜進行獎勵以建立穩固的條件反射；實驗第42 天，在第4 次硬化劑注射完畢后，使用可調速眩暈產生儀進行旋轉刺激，用逃避刺激反射訓練箱中的跳臺裝置測定旋轉刺激前后的跳臺耗時，對比記錄；實驗第43 天，對所有家兔行指標檢測，得出結果后通過綜合評分，將符合后循環缺血性眩暈模型的家兔選出，視為造模成功。

1.2.2 模型評定 自擬后循環缺血性眩暈家兔模型評分量表，給造模家兔進行評分，選出滿足評定標準的家兔，視為造模成功。 （1）旋轉后家兔出現眼震；（2）腦干聽覺誘發電位顯示出現I～V 波型分化差、重復性不良或PL 延長，和/或IPL 延長；（3）腦血流圖顯示椎-基底動脈系統供血較造模前減少20%或以上；（4） 旋轉后跳臺耗時較旋轉前延長6 s 或以上。其中必須滿足第1 條，再加上（2）-（4）中任意1 條者均判定為成功模型。

1.2.3 動物分組及給藥方法 將造模成功的家兔選出，按體質量由小到大編號，采用完全隨機設計方法再分為模型組、西藥對照組、中藥對照組、眩暈定湯劑組、眩暈定顆粒組，共5 組。 模型組以10 mL雙蒸水灌胃； 西藥對照組予以西比靈0.5 mg/(kg·d)溶于10 mL 雙蒸水中灌胃； 中藥對照組以眩暈寧0.165 g／(kg·d)溶于10 mL 雙蒸水中灌胃；眩暈定湯劑組以眩暈定方濃縮液10 mL/(kg·d)灌胃；眩暈定顆粒組以0.5 g/(kg·d) 溶于10 mL 雙蒸水中灌胃。給藥時間為7 d。 灌胃結束后對所有家兔進行標本取材及檢測。

1.2.4 免疫組織化學方法檢測相關因子的表達 實驗結束后，空氣栓塞法處死家兔后，冰盆上迅速取出完整腦組織，置入40 g/L 多聚甲醛液中于4 ℃下固定24 h，截取腦干部分（含較完整的前庭神經核），常規脫水， 石蠟包埋后行冠狀位切片， 片厚4～5 μm。 切片常規脫蠟至水，經30% H2O2甲醇處理，室溫10 min 滅活內源性過氧化物酶， 微波熱修復抗原，滴加5% BSA 封閉液，室溫20 min；滴加適當稀釋的一抗（工作濃度約為1∶200），濕盒內4 ℃孵育過夜，充分漂洗，加入相應生物素化二抗，37 ℃孵育， 漂洗后滴加試劑SABC，37 ℃孵育，PBS 洗滌，，DAB 顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。 用顯微鏡（德國Leica 公司）和Mias2000 圖像分析系統采集圖像。 每張切片隨機選取5個相鄰視野，以切片背景的灰度值作背底校正，對每張切片前庭神經核區Bcl-2、Bax 及BDNF 免疫反應產物進行光密度測定。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 動物存亡情況

按照造模方法“1.2.1”，截止至第6 周，死亡13只，死亡率21%，造模家兔達到眩暈模型標準的共46 只，造模成功率74.2%。 造模致死的原因考慮注射位置及深度把握不當，誤使利多卡因注入延髓導致呼吸麻痹而死。 將造模成功的家兔隨機分為模型組、西比靈組、眩暈寧組、眩暈定湯劑組和顆粒組，共5 組，每組8 只。 各組分別灌胃7 d 后，模型組死亡2 只， 眩暈寧組及眩暈定顆粒組各死亡1 只，西比靈組及眩暈定湯劑組無死亡。 灌胃致死原因考慮灌胃操作不當或手法不熟練誤使藥液灌入肺中導致肺栓塞而死。

2.2 各組Bcl-2 表達的比較

光鏡下， 各組家兔前庭神經核區Bcl-2 陽性神經元染色均以胞漿有棕黃色物質沉積為主， 也有部分胞膜及核膜著色，并可顯示神經元輪廓。 正常組可見大量棕色顆粒，均勻分布，Bcl-2 表達較為明顯，而模型組僅有少量棕色顆粒，偶有Bcl-2 表達。 西比靈組、眩暈定湯劑組和顆粒組可見較多的棕色顆粒，各組數量相當，Bcl-2 的表達接近正常組， 較眩暈寧組明顯。統計結果顯示，模型組家兔前庭神經核區Bcl-2 表達較正常組顯著降低（P＜0.001），而經過藥物干預后的各組家兔Bcl-2 表達較模型組增強 （P＜0.05或P＜0.01），其中以眩暈定湯劑組、眩暈定顆粒組以及西比靈組較為明顯（P＜0.01 或P＜0.001），其三組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。說明眩暈定湯劑及顆粒劑均有上調Bcl-2 基因表達的作用，其療效與西比靈相當。 見表1，圖1。

表1 眩暈定顆粒對眩暈模型家兔前庭相關因子表達情況的影響（±s）

表1 眩暈定顆粒對眩暈模型家兔前庭相關因子表達情況的影響（±s）

注：與正常組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；###P＜0.001；與眩暈寧組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別正常組模型組西比靈組眩暈寧組眩暈定湯劑組眩暈定顆粒組F 值P 值n 8687 8 7 Bcl-2 平均光密度0.31±0.05 0.16±0.02▲▲▲0.25±0.08##0.22±0.05▲▲#0.28±0.07###*0.29±0.06###*5.381＜0.001 Bax 平均光密度0.26±0.05 0.38±0.07▲▲▲0.30±0.04##0.34±0.09▲▲0.26±0.04###**0.27±0.04###*5.543＜0.001 BDNF 平均光密度0.38±0.04 0.22±0.05▲▲▲0.34±0.04###0.30±0.07▲##0.36±0.08###0.38±0.05###*6.294＜0.001

2.3 各組Bax 表達的比較

光鏡下，各組家兔前庭神經核區Bax 陽性神經元染色均以胞漿有棕黃色物質沉積為主，也有部分胞膜及核膜著色，并可顯示神經元輪廓。 正常組偶見棕色顆粒，Bax 的表達不明顯；而模型組有大量棕色顆粒，分布密集，Bax 的表達顯著。 眩暈定湯劑組及顆粒組可見散在棕色顆粒，其數量少于西比靈組及眩暈寧組。 統計結果顯示，模型組家兔前庭神經核區Bax 表達顯著高于正常組（P＜0.001），而經過藥物干預后各組家兔Bax 表達較模型組降低，其中以眩暈定湯劑組、眩暈定顆粒組較為明顯（P＜0.001），其兩組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 說明眩暈定湯劑及顆粒均能下調促凋亡基因Bax 表達，且其療效相當。 見表1，圖1。

2.4 各組BDNF 表達的比較

在光鏡下可見BDNF 免疫組化反應棕黃色陽性物質多存在于神經細胞胞漿、神經突起中，部分膠質細胞也呈陽性，但核不著色，有時可見陽性反應物環細胞表面分布。 正常組可見大量棕色顆粒，均勻分布，BDNF 表達較為明顯，而模型組僅有少量棕色顆粒，偶有BDNF 表達。 西比靈組、眩暈定湯劑組和顆粒組可見較多的棕色顆粒， 各組數量相當，BDNF 的表達接近正常組， 眩暈寧組可見少量棕色顆粒，BDNF 的表達不明顯。 統計結果顯示，模型組家兔前庭神經核區BDNF 表達較正常組顯著降低（P＜0.001），而經過藥物干預后的各組家兔BDNF 表達較模型組都有所增加（P＜0.01），其中以眩暈定湯劑組、 眩暈定顆粒組以及西比靈組較為明顯 （P＜0.001）， 其三組之間比較差異無統計學意義 （P>0.05）。 見表1，圖1。

圖1 各組Bcl-2、Bax、BDNF 的表達光鏡圖（×400）

3 討論

后循環缺血是由椎基底動脈系統缺血引起的病變，是常見的缺血性腦血管疾病，約占所有缺血性腦血管病的20%[6]。 后循環血管走行及分支生理變異大，約60%供應腦干的血管較細，很容易受到血流動力學和血管腔變化的影響。 前庭核團在腦干的分布廣，使其對缺血極其敏感。 因此，后循環缺血患者常有眩暈。 后循環缺血的發病機制包括大動脈狹窄和閉塞引起低灌注、血栓形成及動脈源性栓塞等，主要病理特征是動脈粥樣硬化及在其基礎上形成的血管狹窄[7]。 后循環缺血性眩暈屬中醫“眩暈”范疇。 歷來醫家們認為此病病因病機為本虛標實，以虛為主，主要夾風、火、痰、瘀等。 而目前認為“氣虛血瘀”是最主要的病因病機，也是現代人最普遍的體質特性[8]，這也意味著現代人更易因“虛、瘀”致暈。

根據后循環缺血的病理改變特點和中醫眩暈的病因病機，本實驗采用饑餓+高脂飼料+頸椎旁注射硬化劑+旋轉的復合方法造模， 力求造成與臨床相符的病癥結合的后循環缺血性眩暈動物模型。 中醫認為高脂血癥和動脈粥樣硬化屬于本虛標實，本虛指臟腑虛損元氣不足， 標實指痰濁瘀血交阻內留。 若脾失健運，水谷不化，則釀生痰濁，積聚體內，故有“脾為氣血生化之源”、“脾為生痰之源”之說，故我們選擇“饑餓+高脂飼養”為干擾因素貫穿于整個造模過程。 本實驗前期研究亦證實[9]，高脂飼養能使家兔血液粘稠度增加，降低其腦血流量。 硬化劑注射后， 注射側頸部肌肉會出現頸椎偏斜甚至扭曲。 組織病理學顯示，頸椎側面肌肉和頸動脈管壁組織早期有變性、壞死，后期肌肉纖維化攣縮、動脈管壁纖維化粘連和管腔縮窄等。 提示該方法能使頸部肌肉纖維、攣縮，并可能破壞頸椎力學平衡機制，使頸動脈受到牽張減少其血流，從而導致后循環缺血[10]。

大腦對缺血缺氧十分敏感，腦缺血后繼發的病理生理改變對腦細胞造成的損傷是腦缺血損傷的重要原因之一。 一般認為壞死與凋亡是受損腦細胞死亡的兩大主要機制，當損傷達到一定程度時引起細胞壞死，而低程度的損傷則導致細胞凋亡[11]。 Bcl-2 蛋白家族主要分布于線粒體、 內質網和胞核的外膜，是一組細胞凋亡調控蛋白。 Bcl-2 作為目前首個被確認有抑制細胞凋亡作用的因子，成為腦缺血再灌注損傷的研究熱點之一，其家族成員之間的相互作用對腦缺血后神經細胞的凋亡起了重要的調節作用。 其中Bcl-2 和Bax 作為Bcl-2 家族蛋白的最主要成員，其表達的變化對細胞凋亡起重要的調節作用，兩者的比值決定了細胞是否凋亡：當Bcl-2 表達占優時抑制細胞凋亡，Bax 表達占優時則促進細胞凋亡[12-13]。 BDNF 是在腦內合成的一種蛋白質，它廣泛分布于中樞神經系統，對神經元的生存、分化、生長和維持神經元正常的生理功能起關鍵作用。BDNF 的表達增加，可延緩神經元的壞死和凋亡，并刺激神經血管的生成，最終實現神經生理功能的重建[14]。本實驗結果顯示，模型組家兔與正常組及其他藥物治療組比較， 腦干前庭神經核Bcl-2 及BDNF表達下降，Bax 表達上調，提示此復合造模法能使促進細胞凋亡因素增加，神經保護因素減弱。 考慮其原因可能是長期高脂飲食喂養，導致家兔動脈粥樣硬化，加之頸椎旁硬化劑注射使椎基底動脈狹窄及局部血管炎癥侵潤，造成后循環缺血，繼而腦細胞損傷所致。

“眩暈定方”是導師王凈凈教授在總結中醫諸家對眩暈病因病機論述的基礎上，以“補陽還五湯”作為基礎方，依據《景岳全書·眩暈》“無虛不作眩”，及明·虞摶提出的“血瘀致眩”的理論，在多年臨床經驗中總結的經驗方，具有益氣升清、活血化瘀之功效。 方以黃芪、當歸尾、川芎、牡丹皮、丹參、地龍、防風、葛根等11 味藥組成。 其中黃芪為君藥，能大補脾胃之氣，使氣旺而血行，祛瘀而不傷正；有研究發現[15]，黃芪多糖可通過下調Bax 蛋白的表達對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷產生保護作用。 川芎辛溫香竄，為血中之氣藥；藥理研究表明[16]，川芎嗪可通過上調缺氧缺血大鼠腦組織中的Bcl-2 蛋白表達，下調Bax 蛋白表達，從而抑制神經細胞凋亡，減輕缺氧缺血所致的腦組織損傷。 丹參具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰的功效；試驗研究證實[17]，丹參可抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成， 而調節Bcl-2/Bax 表達及炎癥機制參與可能是其抗動脈粥樣硬化的機制之一；又有研究表明[18]，丹參多酚酸鹽能明顯提升腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中BDNF 及GDNF 的含量，且隨著藥物劑量的增加，其提升作用越發明顯。本研究亦證實，經藥物干預后，眩暈定顆粒可以促進腦干前庭神經核內的Bcl-2、BDNF表達上調， 推測眩暈定顆粒可能通過逆轉粥樣硬化，消除局部炎癥反應，從而改善腦干前庭系統的供血障礙，使腦神經元細胞得到保護。 前期臨床研究已經證實，眩暈定湯劑能明顯改善氣虛血瘀型眩暈患者的中醫證候，其療效確切[3]。 動物實驗研究亦表明[19-20]，眩暈定方能改善椎基底動脈供血不足型眩暈家兔模型大腦的循環血流量， 降低血脂，改善血流變學指標，且安全有效，無明顯毒副作用。 本實驗結果還證實，眩暈定顆粒與眩暈定湯劑療效相當，既保持了湯劑吸收快、作用迅速的特點，又克服了湯劑使用時煎煮不便、服藥量大、易霉變等缺點，發展前景良好，值得在臨床上進行推廣。

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