飼料中粗蛋白測定的影響因素分析

丁進海

摘要 根據(jù)粗蛋白測定過程中的各個步驟研究了飼料中粗蛋白測定中消化爐的溫度、消化爐消化的時間、催化劑用量、硼酸吸收液加堿量、蒸餾時間以及鹽酸濃度等影響因素，并確定一些常規(guī)飼料中蛋白質(zhì)測定的條件。試驗結(jié)果表明，消化溫度為420 ℃時效果最佳，消化時間最好控制在2 h以上，催化劑用量以6.4 g最為準確，硼酸吸收液是否加堿對測定結(jié)果影響較小，蒸餾時間在5 min之后蒸餾完全，鹽酸的濃度選擇則需要根據(jù)試樣的大體粗蛋白含量進行選擇，因此影響消化效果的因素主要有消化溫度、消化時間、催化劑用量。

關(guān)鍵詞 飼料；粗蛋白測定；影響因素；消化溫度；消化時間；催化劑

中圖分類號 S816.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）17-0302-03

粗蛋白是食品以及飼料中含氮化合物的總稱，蛋白質(zhì)是生命活動的基礎(chǔ)，是構(gòu)成生命體細胞、抗體、免疫激素、酶等的主要成分，也是人類以及動物個體補充能量的原料。特別是飼料中蛋白質(zhì)含量的高低或者蛋白質(zhì)的品質(zhì)都很重要，關(guān)乎一些動物個體的生長速度、新陳代謝、繁殖發(fā)育，因此測定飼料中的蛋白質(zhì)對于人類生活顯得尤為重要。如今，隨著人民生活水平的提高，對肉蛋禽類食品的需求量日益增加，而與其對應(yīng)的飼料工業(yè)也快速發(fā)展和進步。雖然粗蛋白測定仍然無法鑒別三聚氰胺、尿素以及添加劑中某些含氮物質(zhì)，但是粗蛋白質(zhì)的含量也大體代表了飼料中蛋白含量，因此飼料中粗蛋白質(zhì)含量的測定也越來越重要[1-3]。

粗蛋白檢測方法有國標法、強堿直接蒸餾法、雙氧水測定法、雙縮脲法、凱氏定氮法，最常用的檢測方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法是影響因素易控制的方法，原理是試樣與濃硫酸和催化劑一同消化，使蛋白質(zhì)遭到破壞，使試樣中的蛋白質(zhì)氮及其他有機氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，加入堿進行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再以酸標準溶液滴定，測出含氮量[4-6]。

凱氏定氮法影響因素：消化溫度對測定飼料中粗蛋白的影響，溫度過高或者過低都會造成數(shù)據(jù)偏高，溫度過低是因為消化不完全，溫度過高會造成氮的散失；消化時間對測定蛋白的影響和消化溫度差不多；催化劑影響了消化的速度；硼酸吸收液也會影響測定的精度；蒸餾時間對結(jié)果也會有影響；選用合適的鹽酸濃度，對測定飼料中粗蛋白的含量精度也很重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗飼料選用大豆粕、進口魚粉、玉米秸稈，其他試驗儀器與試劑詳見《GB/T6432—1994飼料中粗蛋白測定方法》[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 凱氏定氮法測定飼料中的粗蛋白。蛋白質(zhì)是一種含氮有機化合物，飼料中的蛋白質(zhì)包括真蛋白和非蛋白氮，統(tǒng)稱為為粗蛋白，凱氏定氮法適合一些配合飼料、濃縮飼料和一些單一飼料粗蛋白的測定[7]，將試樣中的含氮物質(zhì)經(jīng)過催化劑和濃硫酸的共同消化，把試樣中的含氮有機物轉(zhuǎn)化成硫酸銨的形式，再經(jīng)過凱氏定氮儀進行蒸餾，加堿，使硫酸銨中的氨反應(yīng)生成氨氣。再用硼酸吸收液將氨氣或者氨水吸收，再用鹽酸進行滴定，根據(jù)換算系數(shù)、計算公式，計算出試樣中含有的粗蛋白含量。

1.2.2 消化爐設(shè)定溫度的影響試驗。控制不同設(shè)定溫度，進行單因素試驗，試驗樣品采用大豆粕。溫度設(shè)置380、400、420、440、460 ℃ 5個梯度，設(shè)定空白試驗（即不加大豆粕，其他試驗條件相同）作為對照，根據(jù)凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.2.3 消化爐消化時間的影響試驗。控制不同消化時間進行單因素變量試驗，設(shè)定消化時間分別為30、60、120、180、240、300 min 6個不同的溫度，試驗樣品采用大豆粕，每個溫度稱取2組，再做2個空白組對照試驗，其他試驗條件保持不變，均采用GB/T6432—94中規(guī)定的試驗條件，根據(jù)凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.2.4 催化劑用量的影響試驗。采用硫酸銅∶硫酸鉀=1∶15的混合催化劑進行對比試驗，試驗樣品采用大豆粕，分別設(shè)置3.4、4.4、5.4、6.4、7.4 g 5個不同量的催化劑用量，不同溫度稱取2組，再做2個空白組對照試驗，其他試驗條件保持不變，均采用GB/T6432—94中規(guī)定的試驗條件，根據(jù)凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.2.5 硼酸吸收液加堿的影響試驗。配置不同的催化劑進行單一因素變量試驗，根據(jù)GB/T6432—94中硼酸的配置方法進行配置，設(shè)2個處理，即1 000 mL硼酸吸收液中加入0.5 mL 4%氫氧化鈉（A），硼酸吸收液中不加氫氧化鈉（B），其他試驗因素按照GB/T6432—94中規(guī)定的試驗條件進行蒸餾滴定。并分別做了空白和回收率試驗，每組試驗做了3個平行試驗。在試驗中吸收液的酸堿度是否合適，可以通過以下方式進行簡單的判斷：移取10 mL硼酸吸收液，先加入100 mL蒸餾水，再加入幾滴蛋白指示劑，如果指示劑變色，則說明酸度合適；如果仍然為紅色，那么需要往硼酸吸收液中加適量的堿。硼酸的濃度對結(jié)果影響不大，均能夠完全吸收氨氣，因為硼酸是足夠過量的。由于硼酸是一種酸性極弱的酸，所以pH值比較容易調(diào)節(jié)，而且容易與蒸餾出來的氨結(jié)合形成硼酸銨，利于用鹽酸進行滴定，無其他化學反應(yīng)的干擾。

1.2.6 蒸餾時間的影響試驗。蒸餾時間設(shè)3、4、5、6、7 min 5個梯度，其他因素保持不變，試驗具體操作根據(jù)GB/T6432—94中試驗步驟進行的標準鹽酸滴定溶液測定，根據(jù)凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.2.7 鹽酸濃度的影響試驗。選用0.10、0.05、0.01 mol/L 3個濃度的標準鹽酸滴定溶液和3種蛋白質(zhì)含量不同的樣品（魚粉、大豆粕、玉米秸稈飼料）進行分組交叉試驗，同時分別做空白對照試驗，共12組平行試驗。其他試驗條件保持不變，均采用GB/T6432—94中規(guī)定的試驗條件，根據(jù)凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.3 數(shù)據(jù)計算endprint

設(shè)定3個平行試驗，運用Excel對結(jié)果進行處理制表和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化溫度的影響

控制消化爐溫度試驗結(jié)果見圖1。380、400 ℃的消化管中顏色為不透明的黑色，證明沒有消化完全，而其他溫度下的消化管均為藍色透明。分析數(shù)據(jù)表明，消化溫度以420 ℃效果最佳。

2.2 消化時間的影響

控制消化時間試驗結(jié)果見圖2。30 min消化出的樣品為黑色，60 min為淡藍色，其他時間消化出的樣品均為藍透明色。分析試驗數(shù)據(jù)表明：在樣品變綠后消化30 min蛋白質(zhì)的含量偏低，隨著消化時間的不斷增大，蛋白含量逐漸增加，從2 h開始，蛋白質(zhì)含量增加緩慢，消化2 h的蛋白質(zhì)含量和消化5 h的蛋白含量沒有顯著差異，由此可見樣品消化時間最好控制在樣品變綠后2 h以上。

2.3 催化劑用量的影響

控制催化劑用量的單因素變量試驗結(jié)果見圖3。催化劑用量為3.4、4.4 g的試驗組消化完的樣品顏色均為黑色，催化劑用量為6.4 g的試驗組為藍色透明色，催化劑用量為7.4 g的試驗組樣品消化管內(nèi)壁有黑色渣子。通過試驗數(shù)據(jù)表明，在催化劑用量6.4 g的情況下消化最為完全準確，催化劑用量過多會造成消化管內(nèi)壁有黑色殘渣，催化劑用量太少導(dǎo)致消化不完全，均對結(jié)果有不利影響。

2.4 硼酸吸收液是否加堿的影響

通過控制硼酸吸收液是否加堿用量，探究硼酸吸收液是否加堿對試驗結(jié)果的影響，分析數(shù)據(jù)見表1。可以看出，試驗中硼酸吸收液中加入適量的堿，會導(dǎo)致空白值增大。但是對測定結(jié)果影響并不大，因為硼酸吸收液酸堿度對飼料樣品和空白對照組的作用是一致的，這樣就可以將影響抵消。

2.5 蒸餾時間的影響

對蒸餾時間進行控制的單因素變量試驗結(jié)果見圖4。通過試驗數(shù)據(jù)表明，蒸餾時間在5 min之后，消化管中的游離氨全部被蒸餾出來，被硼酸吸收。3～4 min時未蒸餾完全；5～7 min都在允差范圍內(nèi)，表明蒸餾完全；但是在7 min時，蒸餾液已經(jīng)超過了錐形瓶的2/3，不利于進行滴定試驗。

2.6 鹽酸濃度的影響

對魚粉、豆粕、秸稈飼料3個樣品分別用3種不同濃度鹽酸進行滴定的結(jié)果見圖5～7。通過分析，魚粉組在3種鹽酸濃度中濃度大小與誤差的大小成正相關(guān)關(guān)系，即鹽酸的濃度越小，對測定的結(jié)果差異越大。而玉米秸稈飼料組的數(shù)據(jù)也與鹽酸的濃度成一定的規(guī)律（僅限這3種濃度下），即鹽酸濃度越大，其平行數(shù)據(jù)間的誤差越大，標準差較大。經(jīng)過試驗統(tǒng)計，每種樣品鹽酸滴定的平均消耗用量見表2。通過以上數(shù)據(jù)表格分析，鹽酸在滴定量小于5 mL或者大于40 mL時，滴定誤差比較大，蛋白含量較高時適合用高濃度酸滴定，蛋白含量較低時適合用低濃度的鹽酸滴定溶液更準確。

3 結(jié)論與討論

消化溫度會影響消化的完全程度，從而影響測定粗蛋白的試驗結(jié)果，溫度小于420 ℃會導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏小，溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，氨類物質(zhì)散失，也會導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏小，造成試驗誤差。消化時間的長短就比較容易控制，只要消化時間達到2 h，消化就可以反應(yīng)完全，而超過2 h，試驗數(shù)據(jù)表明，粗蛋白的含量沒有顯著增加或減少，因此建議達到2 h。催化劑用量在6.4 g最為準確，過少導(dǎo)致消化不完全，過多會導(dǎo)致消化管產(chǎn)生黑殘渣；而硼酸對于粗蛋白測定結(jié)果的影響較小，在調(diào)節(jié)pH值加入堿后，試驗滴定空白更加明顯，有利于顏色判斷；蒸餾時間在5 min之后蒸餾完全；鹽酸的濃度選擇則需要根據(jù)試樣的大體粗蛋白含量進行選擇，通過對影響粗蛋白測定的每個因素進行單因素變量試驗的分析，對粗蛋白測定結(jié)果影響最大的是消化階段，而影響消化效果的因素主要為消化溫度、消化時間、催化劑用量。

4 參考文獻

[1] 李成會，朱蓮英.不同消化方法對飼料中粗蛋白質(zhì)測定值的影響[J].江西飼料，2006（2）：25-26.

[2] 朱蓮英，邰秀林.溫度、水分對貯藏中配合飼料蛋白質(zhì)的影響[J].飼料工業(yè)，2005（5）：46-48.

[3] 李興芳，王士長，李廣平.粗蛋白不同測定方法的比較[J]飼料工業(yè)，2003（8）：37-38.

[4] 程彥偉，李培睿，李宗義，等.飼料粗蛋白含量分析方法比較[J].飼料工業(yè)，2001（11）：36-37.

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[7] 飼料中粗蛋白測定方法：GB/T 6432-1994 [S].北京：中國標準出版社，1994.endprint