下調15-LOX-2表達對缺氧狀態下肺動脈平滑肌細胞的影響

劉 曄 邢文婧 李思佳

哈爾濱醫科大學免疫教研室，黑龍江哈爾濱 150081

下調15-LOX-2表達對缺氧狀態下肺動脈平滑肌細胞的影響

劉 曄 邢文婧 李思佳

哈爾濱醫科大學免疫教研室，黑龍江哈爾濱 150081

目的 探討下調15脂氧酶-2（15-LOX-2）對缺氧狀態下肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的影響。方法 將PASMCs隨機分為四組：正常對照組、缺氧組、scramble組、15-LOX-2 siRNA組。實時定量熒光聚合酶鏈反應（Real time PCR）檢測15-LOX-2表達；噻唑藍比色法（MTT）檢測PASMCs增殖情況；酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測15-羥基-二十碳四烯酸（15-HETE）；分析活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）的表達變化。 結果缺氧增加15-LOX-2、15-HETE和ROS的產生，促進PASMCs增殖，減少SOD活性，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。缺氧下轉染15-LOX-2 siRNA可減少15-LOX-2、15-HETE和ROS的產生，抑制PASMCs增殖，增加SOD活性，與缺氧組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結論15-LOX-2下調可通過減少15-HETE產生、調節氧化/抗氧化平衡、調控PASMCs的異常增殖，從而延緩缺氧性肺血管收縮的病理進程。

15-脂氧酶-2；肺動脈平滑肌細胞；15-羥基-二十碳四烯酸；氧化/抗氧化

缺氧可誘導缺氧性肺血管收縮（HPV）發生[1]。哺乳動物由于適應環境而出現HPV。通常一系列肺部疾病如高山病，外科手術如肺移植、單肺麻醉、應激狀態等創傷可誘發HPV[2]。HPV是導致肺動脈高壓乃至肺源性心臟病甚至誘發多臟器衰竭的重要原因[3-4]。研究提示缺氧可促進15脂氧酶-2（15-LOX-2）表達，其產物15-羥基-二十碳四烯酸（15-HETE）可促進缺氧肺動脈環發生收縮反應，提示15-LOX-2與HPV關系密切[5-6]。本研究自2011年1月～2014年12月深入探討了下調15-LOX-2對缺氧狀態下肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

15-HETE酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國Roche公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國invitrogen公司；細胞培養試劑購自美國Hyclone公司；siRNA引物由美國QIAGEN公司合成，引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成；siRNA沉默構建試劑盒購自美國Amaxa Biosystems Technology公司。

1.2 實驗動物

選取健康雄性Wistar大鼠，月齡2個月，SPF級，體重（250±20）g，購于哈爾濱醫科大學附屬二院實驗動物中心（合格證號2001024）。本研究遵循本單位實驗動物保護和使用指南，并經哈爾濱醫科大學實驗動物倫理委員會批準進行。

1.3 方法

1.3.1 肺動脈平滑肌細胞培養和分組 取出大鼠肺動脈，進行PASMCs體外原代培養[7]。取3～8代對數生長期PASMCs細胞用于實驗，隨機分為4組，分別為正常對照組、缺氧組、scramble組和15-LOX-2 siRNA組。缺氧組細胞置于細胞乏氧箱中，通入含92%N2、3% O2、5%CO2的混合氣體，37℃條件下培養24 h。

1.3.2 轉染15-LOX-2 siRNA 15-LOX-2 siRNA引物序列：5'-ATA TCT GCC AAC GTG CTA CGT-3'，siRNA陰性對照引物序列：5'-ACT TCC GTA ATG GAC CTA CGT-3'，轉染步驟依照試劑盒說明進行。轉染后放入細胞乏氧箱中培養24 h后進行后續試驗。

1.3.3 實時定量熒光聚合酶鏈反應（Real time PCR）檢測15-LOX-2 mRNA的表達 用Trizol試劑提取各組PASMCs細胞，進行Real-time PCR檢測。引物序列見表1。反應條件：55℃1 min，循環條件為92℃30 s，50℃45 s，72℃35 s，共進行35個循環。進行數據收集，利用PCR反應儀軟件，將磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為參照，根據熒光定量，計算出所有樣品以及標準品的起始循環數（CT），以標準品Ct值為依據，繪制出標準曲線，再根據2-△Ct法進行半定量分析。

表1 引物序列

1.3.4 15-HETE和氧化應激指標檢測 利用ELISA法檢測15-LOX-2產物15-HETE表達。分光光度法檢測各組SOD活性和活性氧（ROS）含量變化。

3月16日，福建省食品安全委員會辦公室和省食品藥品監管局下發《福建省2018年食品生產加工小作坊示范點創建及考核驗收工作方案》。《方案》提出，在鞏固提升2017年小作坊示范點創建成果的基礎上，到2018年底，全省新建成100家小作坊示范點，通過示范點創建，打造一批生產過程管控嚴格、食品安全有效保障的標桿單位，形成可復制、可推廣的小作坊示范典型，基本形成一點帶一片的良好示范帶動格局，引導和推動福建省小作坊規范生產、健康發展。此外，福建省從2018年省級食品安全專項資金中安排200萬元，通過以獎代補的方式對評選確定為示范點的小作坊（不含廈門）給予補助，補助標準為2萬元/家。

1.3.5 噻唑藍比色法（MTT）法檢測PASMCs增殖變化

利用MTT法檢測各組PASMCs增殖的變化。收集對數生長期PASMCs細胞，用含10%胎牛血清DMEM培養液以5×103個的細胞數接種于96孔培養板，培養24 h后棄去上清，隨機分為4組：正常對照組、缺氧組、scramble組、15-LOX-2 siRNA組，處理方法同上。24 h后待測孔中加入20 μL無菌MTT，每個時間點設3個復孔；繼續培養4 h后，徹底去除上清，加入DMSO 150 μL/孔，搖床振蕩10 min，至紫色結晶充分溶解后，置酶標儀于570 nm波長處測定其吸光度（A）值，計算各組增殖率。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組樣本均數的比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組15-LOX-2 mRNA的表達變化

缺氧可上調PASMCs中15-LOX-2 mRNA表達，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。15-LOX-2 siRNA可降低缺氧PASMCs中15-LOX-2，與缺氧組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組15-LOX-2 mRNA的表達變化

缺氧可增加PASMCs中15-HETE生成，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。下調15-LOX-2后，可降低缺氧PASMCs中15-HETE生成，與缺氧組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組15-HETE的生成情況

2.3 下調15-LOX-2對缺氧狀態下PASMCs增殖的影響

缺氧可促進PASMCs顯著增殖，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。下調15-LOX-2可減少缺氧PASMCs的增殖，與缺氧組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 下調15-LOX-2對缺氧狀態下PASMCs增殖的影響

2.4 各組氧化應激指標分析

缺氧可促進PASMCs中ROS產生，降低SOD含量，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。下調15-LOX-2可抑制ROS的產生，增加SOD含量，與缺氧組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組氧化應激指標分析（）

表2 各組氧化應激指標分析（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與缺氧組比較，#P＜0.05；15-LOX-2：15脂氧酶-2；ROS：活性氧；SOD：超氧化物歧化酶

組別 ROS SOD正常對照組缺氧組Scramble組15-LOX-2 siRNA組107.5±35.6 291.9±27.5*286.5±31.2*128.6±41.7#117.3±11.6 47.6±6.1*52.3±5.3*99.5±15.2#

3 討論

缺氧指組織供氧不足或用氧障礙，從而引起其代謝、功能以致形態結構發生異常變化的病理過程。缺氧時機體的功能代謝發生變化，呼吸系統、循環系統、血液系統、腦中樞、組織細胞都發生代償性反應甚至功能障礙。缺氧可以通過直接作用于PASMC膜，也可以直接促進PASMCs增生，引起機體血管緊張素、一氧化氮、細胞因子以及離子濃度的變化，促進HPV發生，各器官代謝、功能和結構發生異常變化，可誘發肺動脈高壓、心力衰竭[8-10]。

15-LOX-2是20世紀90年代被新鑒定出的同工酶[11]，與其另外一種同工酶15-LOX-1在分布以及生物學特性存在不同，15-LOX-1廣泛分布于身體各組織不同，15-LOX-2組織分布局限，僅在mRNA水平探查到存在于前列腺、皮膚、角膜等處[12]。而在前期研究中證實15-LOX-2在正常肺組織中不表達，但在HPV中表達顯著增加[4]。15-LOX-2主要作用于花生四烯酸生成15-HETE[13]。15-LOX-2和其作用產物在炎癥過程中起著重要的作用。它們不僅可以調控白三烯的形成還可以抑制白三烯的生理功能[14-16]。它可以調節炎性反應引起的中性粒細胞的趨化作用[13]，其催化生成的產物15-HETE不僅可以作為脂氧素的底物，還可以抑制人類中性粒細胞超氧陰離子的產生[17-18]。因此本研究通過成組設計分析下調15-LOX-2對缺氧PASMCs的作用和機制。本研究證實利用siRNA技術干擾15-LOX-2的表達，可顯著下調15-LOX-2，同時可抑制其產物15-HETE的產生，而通過調控15-LOX-2和其產物的表達，可以抑制PASMCs的異常增殖。研究表明，15-HETE是HPV的中間環節，同時研究提示缺氧時肺動脈內生成的15-HETE主要來源于15-LOX-2途徑，上述研究說明15-LOX-2在HPV中發揮關鍵作用[19-20]。因此本研究結果提示15-LOX-2在HPV中主要通過作用花生四烯酸產生產物15-HETE，影響缺氧條件下PASMCs的增殖，從而調控HPV。

研究報道提示，缺氧還可引起機體氧化還原平衡紊亂，降低SOD等抗氧化酶的活性，增加活性氧族的生成，如ROS等氧自由基大量生產，進而促進HPV發生[21-23]。因此本研究進一步深入探討下調15-LOX-2對缺氧條件下PASMC中氧化還原平衡的影響，結果顯示，通過下調15-LOX-2在HPV中的表達，可促進SOD活性恢復，并抑制ROS氧自由基的產生，進而調控氧化/抗氧化環節，促進氧化還原平衡恢復，有助于延緩HPV的病理進程。

本研究提示15-LOX-2在HPV調控中發揮重要作用，可以為臨床防控HPV治療靶點選擇提供參考和理論依據，并有助于闡釋HPV發生機制的研究。

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Effect of 15-lipoxygenase-2 down-regulation on hypoxic pulmonary arterial smooth muscle cells

LIU Ye XING Wenjing LI Sijia
Teaching and Research Office of Immunology,Harbin Medical University,Heilongjiang Province,Harbin 150081, China

Objective To explore the effect of 15-lipoxygenase-2 (15-LOX-2)down-regulation on hypoxic pulmonary arterial smooth muscle cells(PASMCs).Methods PASMCs were randomly divided into 4 groups,normal control group, hypoxic group,scramble group and 15-LOX-2 siRNA group.Real time PCR was used to detect the expression of 15-LOX-2.Proliferation of PASMCs was examined by MTT assay.ELISA was employed to detect 15-hydroxyeicosatetraenoic acid(15-HETE).The changes of reactive oxygen species(ROS)and superoxide dismutase(SOD)were analyzed.Results During hypoxia,the expression of 15-LOX-2,15-HETE,ROS and PASMCs proliferation were increased,the activity of SOD reduced,there were statistically significant differences compared with normal control group (P＜0.05).After transfection of 15-LOX-2 siRNA during hyoxia,15-LOX-2,15-HETE,ROS and PASMCs proliferation were down-regulated,while SOD activity increased,there were statistically significant differences compared with hypoxic group (P＜0.05).Conclusion 15-LOX-2 down-regulation can inhibit 15-HETE formation and abnormal PASMCs proliferation,regulate oxidant/antioxidant balance,which delays pathological process of HPV.

15-lipoxygenase-2;Pulmonary arterial smooth muscle cells;15-hydroxyeicosatetraenoic acid;Oxidation/ anti-oxidation

R563.9

A

1673-7210（2015）11（c）-0026-04

2015-08-10本文編輯：張瑜杰）

黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12511177）。

劉曄（1978.4-），女，博士，副教授；研究方向：呼吸系統疾病的發病機制和防治。