DNA-蛋白激酶依賴蛋白激酶催化亞基在鼻咽癌中的表達及意義

黃 俐 徐細明 蒿艷蓉 楊 姣 陳甲信 李 雷 陳俊萍 陳朝紅

1.武漢大學人民醫院腫瘤中心，湖北武漢 430000；2.廣西壯族自治區人民醫院腫瘤中心，廣西南寧 530000

DNA-蛋白激酶依賴蛋白激酶催化亞基在鼻咽癌中的表達及意義

黃 俐1，2徐細明1蒿艷蓉2楊 姣2陳甲信2李 雷2陳俊萍2陳朝紅2

1.武漢大學人民醫院腫瘤中心，湖北武漢 430000；2.廣西壯族自治區人民醫院腫瘤中心，廣西南寧 530000

目的 探討DNA-蛋白激酶依賴蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）在鼻咽癌中的表達及其臨床意義。 方法選取2007年5月～2012年7月于廣西壯族自治區人民醫院腫瘤中心的83例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）和32例鼻咽炎患者（鼻咽炎組），通過免疫組織化學的研究方法分析DNA-PKcs的表達情況，并通過分層分析的方法評估DNA-PKcs與鼻咽癌臨床病理學因素之間的聯系，進一步分析DNA-PKcs的表達與鼻咽癌預后之間的相關性。結果鼻咽癌患者DNA-PKcs的表達明顯高于鼻咽炎患者，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；DNA-PKcs的表達水平與鼻咽癌的病理分型、臨床分期、體力量表評分、年齡、性別無關（P＞0.05）；DNA-PKcs的表達水平與鼻咽癌患者的近期療效無顯著相關性 （P＞0.05）；DNA-PKcs的表達水平越高，鼻咽癌患者的遠期生存時間越長 （P＜0.01）。 結論DNA-PKcs在鼻咽癌中高表達可以作為一個鼻咽癌預后的預測指標。

DNA-蛋白激酶依賴蛋白激酶催化亞基；鼻咽癌；鼻咽炎；免疫組化

鼻咽癌是我國南方普發的一種上皮性腫瘤[1-2]。我國的鼻咽癌人群幾乎占亞洲國家鼻咽癌患者的50%。由于鼻咽癌組織對輻射具有高度敏感性，因此臨床上通常將放射治療作為鼻咽癌患者的首選治療方案[3-5]。隨著近代醫學技術的發展，鼻咽癌的5年生存率已經超過了50%[6]，但是仍然有大量鼻咽癌患者發生放療后腫瘤進展的情況[7-9]。因此，找到提高鼻咽癌患者放療敏感性的靶點，成為了突破鼻咽癌治療的關鍵點[10-11]。本研究在課題組前期研究結果上進一步擴大樣本量，通過分析DNA-蛋白激酶依賴蛋白激酶催化亞基（catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs）在鼻咽癌和鼻咽炎組織中表達的差異，進一步探討DNA-PKcs與鼻咽癌預后的相關性，從而期望為鼻咽癌找到一些潛在的放療增敏的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2007年5月～2012年7月廣西壯族自治區人民醫院（以下簡稱“我院”）腫瘤中心經病理診斷的患者中符合條件的83例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）和32例鼻咽炎患者（鼻咽炎組）為研究對象。所有患者均在我院耳鼻喉專科經鼻咽部活檢取得新鮮組織標本，制成石蠟包埋組織塊，連續做4 μm厚切片。每個患者的組織標本均切片5張備用。鼻咽癌患者入組條件：①年齡18～76歲；②體力量表評分（PS評分）≤2分；③所有病例均為初診患者且未接受過任何抗腫瘤治療；④經全身檢查排除其他疾病且無腫瘤轉移病史和其他腫瘤病史；⑤根據美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）的推薦，所有鼻咽癌患者按照美國癌癥聯合委員會（AJCC）sixth Edition 2002版分期，其中Ⅰ～Ⅱ期患者僅接受調強放療，而Ⅲ～ⅣB期患者則行同步放化療（CRT）治療合并或不合并必要的輔助化療；⑥治療前所有鼻咽癌患者均經鼻咽+顱底+頸部MRI平掃+增強檢查，檢查結果作為基線水平。鼻咽炎患者入組條件：①年齡18～76歲；②經全身檢查排除其他疾病。本研究經過了我院倫理委員會的許可，并征得了每個患者同意。

1.2 治療方案

根據鼻咽癌NCCN 2007版指南推薦，Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者接受單純根治性調強放療（IMRT）。IMRT方案：①鼻咽部：總劑量68～76 Gy，1次/d，2.12～2.30 Gy/次，共30～35次；②頸部陽性淋巴結：GTVn總劑量60～70Gy，1次/d，1.80～2.16 Gy/次，共30～35次；③頸部陰性淋巴結：CTVn總劑量50～55 Gy，1次/d，1.56～1.70 Gy/次，共30～35次。

表1 83例鼻咽癌患者的臨床資料

Ⅲ期和Ⅳ期的鼻咽癌患者接受以鉑類為主的同步放化療。IMRT方案：同Ⅰ和Ⅱ期患者。化療方案：順鉑40 mg/m2，1次/周，6～7周。放療第1天同步開始給藥。同步放化療1個月后采用CT或MRI進行療效評價。療效評價不能達到完全緩解（CR）或部分緩解（PR）的患者，再行輔助化療。

1.3 實驗方法

①60℃烤箱中烤片2 h。②切片浸泡于二甲苯中脫蠟，15 min/次，一共3次。然后按從高濃度到低濃度的順序，依次將切片浸泡于梯度酒精（酒精濃度依次為100%、95%、90%、80%、70%）中，每個濃度中均浸泡5 min。雙蒸水洗片5 min/次，一共3次。PBS洗片5 min/次，一共3次。③切片浸泡于檸檬酸鹽溶液（pH值6.0）中，置于高壓鍋內95°C煮沸2 min/次，連續3次，每2次間隔1 min。自然晾至室溫。PBS洗片5 min/次，一共3次。④將切片浸泡于3%雙氧水中10 min，PBS洗片5 min/次，一共3次。⑤26℃環境中用正常綿羊血清封閉組織15 min。⑥傾去血清，用稀釋后的DNA-PKcs單克隆一抗（兔抗人單克隆抗體購自北京博奧森公司，稀釋比例1∶200）4℃孵育過夜。⑦切片置于室溫復溫20 min后，用PBS洗片5 min/次，一共3次。然后用多克隆二抗26℃孵育15 min，PBS洗片5 min/次，一共3次。⑧用DAB顯色試劑顯色5～10 min，顯微鏡下觀察顯色結果，適時終止。用自來水輕柔沖洗片刻。⑨用蘇木精復染1 min，自來水沖洗片刻，1%的鹽酸酒精溶液分化3 s，自來水沖洗片刻后，用氨水返藍1 min。⑩按從低濃度到高濃度的順序，依次將切片浸泡于梯度酒精 （酒精濃度依次為70%、80%、90%、95%、100%）中脫水5 min，然后浸泡于二甲苯中15 min/次，一共3次。最后用中性樹脂封片固定。電子顯微鏡觀測計數。說明：免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司；每一批次實驗中均設置陽性對照片和陰性對照片；已知陽性反應標本作為陽性對照，與實驗切片采用同種一抗、二抗；PBS代替一抗作為陰性對照進行同步染色。

1.4 結果評價標準

1.4.1 免疫組化結果評價 DNA-PKcs陽性物質表達主要定位于細胞核。由3名經驗豐富的病理科醫生在不知患者臨床資料的情況下采用Volm雙評分法經電子顯微鏡下進行結果評估。每張切片選取5個高倍鏡視野觀察。評價標準：按陽性細胞數比率評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分；按染色強度評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。二者分數相加即為判斷結果：陰性（-）：0分；弱陽性（+）：1～2分；中度陽性（++）：3～4分；強陽性（+++）：5～6分。

1.4.2 鼻咽癌患者療效評價判定 83例鼻咽癌患者按計劃完成相應治療1個月后，采用鼻咽+顱底+頸部MRI平掃+增強檢查，與治療前MRI結果對比后進行療效評價，療效評價參照國際上通用實體瘤的療效評價標準（RECIST）1.1版指南[12]。

1.5 隨訪情況

所有病例從患者出院后開始進行定期常規隨訪，隨訪日期截至2014年10月。常規隨訪評價第1年與第2年，每3個月進行1次，然后在接下來的3年，每6個月進行1次，此后每年（或當臨床癥狀提示有必要時）進行1次。中位隨訪時間27個月。至隨訪結束，26例患者發生腫瘤遠處轉移，12例肝轉移，9例肺轉移，5例骨轉移。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，生存時間的關系用Kaplan-Meier生存曲線進行單因素分析，生存曲線的差異性分析用log-rank檢驗，鼻咽癌患者無轉移生存多因素分析采用Cox模型進行，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果

根據Volm雙評分法評價，鼻咽癌患者中DNA-PKcs強陽性表達者占18.07%（圖1A，見封四），中度陽性表達者占33.73%，弱陽性表達者占13.25%，陰性表達者占34.93%（圖1B，見封四）。而鼻咽炎患者中DNAPKcs強陽性占0.00%，中度表達者占6.25%，弱陽性表達者占15.63%，陰性表達者占78.13%。二者之間DNA-PKcs的表達情況存在顯著差異 （P=0.007），鼻咽癌患者的DNA-PKcs表達明顯高于鼻咽炎患者。見表2。

表2 83例鼻咽癌患者與32例鼻咽炎患者DNA-PKcs的表達情況（例）

2.2 DNA-PKcs的表達情況與臨床資料之間的關聯

經過多因素分析，鼻咽癌DNA-PKcs的表達情況與性別、年齡、病理分型、AJCC分期、PS評分因素均無明顯關聯（均P＞0.05）。見表3。

表3 鼻咽癌患者DNA-PKcs的表達情況與臨床因素的相關性分析（例）

2.3 DNA-PKcs的表達情況與鼻咽癌患者近期療效的相關性分析

根據RECIST 1.1版指南對鼻咽癌的近期療效進行評估，所有鼻咽癌患者均達到了CR或PR，客觀緩解率達100%。本研究進一步考察患者的DNA-PKcs表達情況與患者鼻咽癌CR是否有關聯。結果顯示DNA-PKcs的表達與鼻咽癌的近期療效無顯著相關性（P＞0.05）。見表4。

表4 DNA-PKcs的表達情況與鼻咽癌患者近期療效的相關性分析（例）

2.4 鼻咽癌無轉移生存的多因素分析

應用Cox模型對83例鼻咽癌患者無轉移生存率進行多因素生存分析，結果顯示DNA-PKcs的表達水平是影響鼻咽癌患者預后的獨立因素（P＜0.05）。見表5。

表5 鼻癌咽患者無轉移生存的多因素分析

2.5 DNA-PKcs的表達水平與患者生存時間分析

本研究應用Kaplan-Meier生存曲線對DNAPKcs的表達情況與鼻咽癌患者生存時間關系進行單因素分析發現DNA-PKcs的總體表達水平和患者的生存時間呈正相關（P＜0.01），見圖2。DNA-PKcs的表達水平越高，患者的生存時間越長。根據總體生存曲線，筆者可以推測DNA-PKcs的陽性表達組和陰性表達組之間生存時間相差較大，而各個陽性表達組之間的生存時間沒有明顯區別。本研究按DNA-PKcs陽性和陰性表達分組，單獨做出生存曲線，可以證實前面的推測，兩組之間的區別很明顯（P＜0.01）。見圖3。

圖2 不同DNA-PKcs表達水平下的生存曲線比較

圖3 DNA-PKcs陽性表達組與陰性表達組之間的生存曲線比較

3 討論

惡性腫瘤的發生往往伴隨著遺傳物質的異常改變[13-15]。各種外源性或內源性的因素對DNA的累積損傷會導致細胞正常增殖分化生長機制紊亂，從而形成持續性異常細胞微環境，導致腫瘤的發生[11]。但機體中也存在對抗DNA損傷的因子，DNA-PKcs就是主要從事DNA雙鏈斷裂修復的一種腫瘤抑癌基因[16-17]。DNA-PKcs是PI3K家族中的一員，是DNA依賴蛋白酶的催化亞單位[18]。當機體DNA受到一定損傷斷裂，會自動啟動NHEJ修復機制，DNA-PKcs作為修復家族的一員會參與DNA斷裂的非同源末端連接的修復，同時，DNA-PKcs可以維持人體正常免疫功能，調節DNA修復，防止細胞進一步惡變[19]。

本研究結果顯示，鼻咽癌中DNA-PKcs的表達水平高于鼻咽炎組織，這提示DNA-PKcs對于正常組織細胞DNA具有修復作用。炎癥組織中DNA斷裂損傷較少，修復基因DNA-PKcs的含量也較少。但進一步研究分析卻發現鼻咽癌中DNA-PKcs的表達水平越高，鼻咽癌患者的預后反而越好。腫瘤組織中高水平表達的DNA-PKcs能一定程度上修復斷裂損傷的DNA，因此，DNA-PKcs高表達的患者預后相應比低水平的患者好。但值得注意的是，DNA的修復只能是一定程度上的，如果斷裂程度高、斷裂的DNA數量多，腫瘤依然大體上呈進展趨勢[20-21]，這與本研究中的分層分析結果一致。但是，有些學者卻正好得出與本實驗相反的結論，Yan等[21]的研究結果表明DNA-PKcs表達水平越低鼻咽癌放療效果越好，這也許與入組人群有關，其研究入組的患者年齡相對本實驗偏小。另外，這一結果和不同醫院的放療效果也相關。鑒于關于DNA-PKcs在鼻咽癌中的表達水平的報道目前還很少，這一爭論還有待繼續驗證。關于DNA-PKcs在鼻咽癌中作用機制也有待于進一步探討。但是，值得肯定的是DNA-PKcs未來被作為鼻咽癌的診斷靶點是很有可能的。

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The expression and clinical significance of DNA-PKcs in nasopharyngeal carcinoma through hierarchical analysis

HUANG Li1,2XU Ximing1HAO Yanrong2YANG Jiao2CHEN Jiaxin2LI Lei2CHEN Junping2CHEN Zhaohong2

1.Department of Cancer Center,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan 430000,China;2.Department of Cancer Center,People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530000,China

Objective To explore the expression and the clinical significance of DNA-PKcs in nasopharyngeal carcinoma.Methods Diagnostic tissues of 83 nasopharyngeal carcinoma patients(nasopharyngeal carcinoma group)and 32 nasopharyngitis patients(nasopharyngitis group)from Cancer Center of People's Hospital of Guangxi Autonomous Region from May 2007 to July 2012 were evaluated retrospectively.The expression of DNA-PKcs was analyzed by immunohistochemical and the relationship between the expression of DNA-PKcs and the clinical pathological factors in nasopharyngeal carcinoma were evaluated through the retrospective study methods.Results The expression of DNA-PKcs existed between nasopharyngeal carcinoma patients and nasopharyngitis patients,and the differences were statistically significant(P＜0.01).However,there was no relevance between the expression of DNA-PKcs and pathology classification, clinical stage,PS score,age or gender(P＞0.05).The expression level of DNA-PKcs had no relationship with the recent efficacy of patients with nasopharyngeal carcinoma,and the difference was not statistically significant(P＞0.05).The long-term survival of patients with nasopharyngeal carcinoma was longer,when the expression level of DNA-PKcs was higher,and the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion High expression of DNA-PKcs can be used as a predictor of prognosis in nasopharyngeal carcinoma.

Catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase;Nasopharyngeal carcinoma;Nasopharyngitis;Immunohistochemical

R739.6

A

1673-7210(2015)11(b)-0004-05

2015-04-27本文編輯：關 婧）

國家自然科學基金資助項目（81260348）；廣西衛生廳重點項目（桂衛重2010037）。

黃俐（1989.8-），女，武漢大學2012級腫瘤學在讀碩士研究生（武漢大學人民醫院與廣西壯族自治區人民醫院聯合培養），主要從事惡性腫瘤臨床及基礎學的研究工作。

徐細明（1976.8-），男，博士，主任醫師，教授，碩士研究生導師，擅長消化道腫瘤的綜合治療。蒿艷蓉（1967.11-），女，博士，副主任醫師，碩士研究生導師，主要從事惡性腫瘤的臨床及基礎的研究工作。