桑樹AKR2A伴侶蛋白基因的克隆及分析

劉 巖，沈國新，計東風，朱 燕，林天寶，呂志強

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蠶桑研究所，浙江杭州 310021）

桑樹AKR2A伴侶蛋白基因的克隆及分析

劉 巖，沈國新，計東風，朱 燕，林天寶，呂志強*

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蠶桑研究所，浙江杭州 310021）

通過RACE等生物學技術，從桑葉中克隆獲得AKR2A同源基因。cDNA全長1 488 bp，ORF長為1 050 bp，編碼349個氨基酸。編碼蛋白預測分子量為37.31 ku，等電點4.43；富含螺旋結構，與同類蛋白同源性較高。鹽脅迫后AKR2A在根組織中表達量上升，在不同桑樹品種葉片中表達豐度存在差異。

伴侶蛋白；AKR2A；桑樹

高溫會嚴重破壞植物細胞加工進程，影響蛋白降解，產(chǎn)生毒性非特異性反應。為此，植物進化出一種保護機制，其中包括產(chǎn)生大量熱激蛋白（small heat shock protein，sHsps）應對脅迫［1］。這些蛋白具有分子伴侶活性，可阻止熱脅迫誘導蛋白變性、非特異性降解。此外，這些蛋白也響應其他脅迫，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。

AKR2A和AKR2B（ankyrin repeat-containing protein，AKR2）與GF14相互作用［2］，可識別葉綠體外膜蛋白信號，將它們轉(zhuǎn)運至葉綠體外膜。植物外膜蛋白包含有一個N端跨膜結構域（transmembrance protein，TMD），需要一個葉綠體錨定信號。AKR2A能結合APX3側翼結構域，充當APX3的分子伴侶蛋白，阻止翻譯后APX3的降解，對植物生長代謝、發(fā)育都有重要作用［3-4］。目前擬南芥AKR2A蛋白已經(jīng)有研究報道，為了對桑樹AKR2A同源基因進行了解，開展與之相互作用蛋白的篩選，分析AKR2A對桑樹生長發(fā)育與代謝的調(diào)控機制，本研究利用RACE等技術，克隆桑樹AKR2A同源基因，并對其進行表達及生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗用桑葉樣品均采自浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所實驗苗圃。

1.2 主要試劑

大腸桿菌Dh5α由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所保存；5＇和3＇RACE試劑盒購自Clontech生物技術公司；RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR酶反應系統(tǒng)、T-Vector購自全式金生物有限公司；DNA膠回收試劑盒購自鼎國生物有限公司，測序和PCR引物均由上海生工生物工程公司完成。

1.3 桑葉RNA抽提及RT-PCR

采集新鮮桑葉，參照TransZol plant操作說明，抽提樣品總RNA，紫外分光光度法測定總RNA濃度，并通過電泳檢測抽提RNA純度。每個RNA樣品取500 ng，參照操作說明書步驟進行RT轉(zhuǎn)錄反應；根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的AKR2A序列信息，設計兼并引物對MaAKR2A-F（5＇-GGYARYGC NYTVATGCAGGA-3＇，其中Y=C/T；R=A/G；N=A/T/C/G；V=A/C/G）和MaAKR2A-R（5＇-TCRATTGMGCRCAYTTCAVCTC-3＇，其中R=A/G；M=A/C；Y=C/T；V=A/C/G）進行擴增。

PCR反應程序為：94℃預變性5 min，然后94℃變性1 m in，56℃復性1 min，72℃延伸30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。上述PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，割膠回收對應的產(chǎn)物，與Easy以適當?shù)谋壤B接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1細胞，然后篩選鑒定陽性克隆，送交上海生工生物技術有限公司測序。

1.4 5＇-和3＇-RACE

根據(jù)Clontech公司試劑盒操作說明，1.5 min在上述測得的序列區(qū)域內(nèi)分別設計用于5＇和3＇RACE的特異性引物GSP-AKR2-R（5＇-CTTCC CTCCGAATCTTCCTCGTCCT-3＇）和GSP-AKR2-F（5＇-GTCTTGCCGCTTCTGGTGATCCAGCTACTTC-3＇）分別進行兩端RACE擴增，回收PCR產(chǎn)物，與Easy T以適當?shù)谋壤B接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1細胞，然后篩選鑒定陽性克隆，送交上海生工生物技術有限公司測序。

根據(jù)RACE結果，設計擴增全長MaAKR2A基因的引物AKR2-ORF-F（5＇-ATGGCGTCTAATTCG CAGAAGGATTC-3＇）和AKR2-ORF-R（5＇-TTACAG GAAGGCATCCTTCTCGAGC-3＇），經(jīng)克隆后測序。

1.5 生物信息學分析

將MaAKR2A基因cDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，與家蠶的全基因組序列進行BLAST比對，分析MaAKR2A基因的基本結構信息。通過軟件CLUSTAL X（ver.1.83）推導出MaAKR2A cDNA編碼產(chǎn)生的氨基酸序列，并對MaAKR2A蛋白的基本特性進行分析。蛋白序列提交Blast（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/），分析蛋白的保守結構域。將MaAKR2A的氨基酸序列提交https：// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？page =npsa-sopm.htm l，結合系統(tǒng)展現(xiàn)的蛋白的高級結構分析蛋白功能；并利用PHYLIP軟件對MaAKR2A蛋白進行比對分析。

1.6 表達譜分析

1.6.1 對鹽脅迫前后不同幼苗的轉(zhuǎn)錄表達分析

桑種子發(fā)芽長出2片真葉時，隨機挑選10株置于100 mmol·L-1NaCl浸潤濾紙的平皿中24 h，同時設置蒸餾水組為對照。分別采集處理前后，處理組、對照組根、莖、葉片樣品，同上抽提 RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。利用設計的引物AKR2A-F（5＇-CAAAATCCCCAGTTTATGACCA-3＇）和AKR2A-R（5＇-CCATTGCTTCACCCAACTTCT-3＇）進行定量PCR檢測，并以MaActin的Actin-F（5＇-TGAAG GCTGGGTTTGCTGGT-3＇）和Actin-R（5＇-GCTCGT TGTAGAAAGTGTGATGC-3＇）引物對的擴增作為內(nèi)參，按照全式金公司real-time PCR kit操作說明，在StepOne熒光定量PCR儀上進行定量PCR檢測（美國ABI生物公司），按照2-△△Ct方法統(tǒng)計分析不同轉(zhuǎn)基因純化株系的表達。

1.6.2 對不同品種桑樹葉片中AKR2A的轉(zhuǎn)錄表達水平分析

選取9個不同桑樹品種，取同葉位葉片，分布抽提RNA，進行反轉(zhuǎn)錄后，利用定量檢測引物按照全式金公司real-time PCR kit操作說明，在StepOne熒光定量PCR儀上進行定量PCR檢測（美國ABI生物公司），按照2-△△Ct方法統(tǒng)計分析MaAKR2A的轉(zhuǎn)錄表達量。

2 結果與分析

2.1 M aAKR2A cDNA序列的克隆

根據(jù)AKR2A的保守區(qū)設計兼并引物，以此擴增獲得MaAKR2A的保守序列片段。經(jīng)3＇和5＇RACE擴增后，得到特異性擴增產(chǎn)物條帶 （圖1）?？寺∠鄳蛄?，經(jīng)拼接得到全長的MaAKR2A cDNA序列 （圖2）。序列全長1 488 bp，含一個完整的開放閱讀框編碼349個氨基酸。

圖1 MaAKR2A的擴增產(chǎn)物

2.2 桑樹AKR2A基因的結構特點

經(jīng)預測比較分析，桑樹AKR2A編碼蛋白分子量為37.31 ku，等電點p I為4.43.在C端含有ANK保守結構域 （圖3），序列富含螺旋Helix結構 （圖4）。

2.3 進化比較分析

桑樹AkR2A蛋白與同類蛋白同源性較高，與桃樹來源蛋白的（M5VQ6，Prunus persica）同源性最高，達85.4%；相對而言，與云杉 （A9NRF1，Picea sitchensis）的同源性最低，為69.1%，在不同品種間保守性較高 （圖5）。

2.4 不同桑葉葉片AKR2A的表達譜活性

隨機克隆5個品種桑樹AKR2A基因的全長ORF序列，測序表明序列間無明顯差異。選擇9個品種桑樹葉片，通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，不同品種間表達量有較大差別，以圍西、荷葉白、強桑和上清4個品種居高，另外臺青、GM5、建水長穗桑、農(nóng)桑14、8632桑品種中，該基因表達量顯著低于前面4個品種 （圖6）。

圖2 MaAKR2A cDNA的核苷酸序列及推導的氨基酸序列

通過100 mmol·L-1NaCl鹽脅迫雜交桑幼苗24 h后，分別取不同組織樣品，以未脅迫正常組織為對照，通過定量檢測發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后根組織中AKR2A基因相對表達量上升，而葉、莖中相對表達含量略呈下降態(tài)勢，但總體變化程度不大（圖7）。

圖3 MaAKR2A蛋白保守結構域分析

圖4 MaAKR2A蛋白二級結構的預測

圖5 不同品種來源AKR2A蛋白的進化分析

3 小結和討論

膜蛋白的正確定位對真核蛋白功能的發(fā)揮起重要作用，膜蛋白通常有2種合成途徑，一種是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜合成，在Sec61膜蛋白幫助下形成復合物，通過膜囊泡轉(zhuǎn)運至目的地；另一種是在細胞質(zhì)游離核糖體中，然后通過分子伴侶和受體蛋白錨定到靶膜上［5］。AKR2A是一種很重要的分子伴侶蛋白，與之相互作用的蛋白中，C端 （如APX3，APX5，CB5和TOM20）、N端（OEP7和CB5R）、靠近C端 （TOC34）均含有 ABS（AKR2A-binding sequence，ABS）。Zhang等［6］推測ABS在膜上位置不影響AKR2A功能，AKR2A與單一ABS結構域蛋白結合。AKR2A結合膜蛋白的ABS，可能在組織膜蛋白特異性受體作用下轉(zhuǎn)運至指定位置。AKR2A含有4個C端的ankyrin repeats和一個N端PEST結構域［2］，前者是蛋白相互作用結構域，后者是指富含Pro，Glu，Ser和Thr，降解短壽命蛋白信號域。Shen等［4］報道AKR2A可以與APX3相互作用。本文克隆鑒定了桑樹AKR2A基因，為今后圍繞該基因開展桑樹生長發(fā)育和代謝調(diào)控研究提供了理論基礎。

圖6 不同品種間MaAKR2A基因轉(zhuǎn)錄表達水平的比較

圖7 NaCl脅迫后不同組織AKR2A基因表達量變化

本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后，相對于葉、莖組織而言，AKR2A基因在植物根組織中表達水平提高，這可能與鹽離子進入質(zhì)膜，根細胞代謝發(fā)生變化，需要更多的AKR2A參與調(diào)控各類脅迫響應蛋白；而Eugenia等［7］對脅迫條件下抗壞血酸的表達檢測研究發(fā)現(xiàn)，植物損傷后前3 h內(nèi)AKR2A表達量增加。另外，研究檢測發(fā)現(xiàn)不同品種桑樹AKR2A基因表達水平存在較明顯差異，而AKR2A又能與APX3，Hsp17.8等發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)膜蛋白合成轉(zhuǎn)運［8］，不同桑樹品種AKR2A的表達調(diào)控及其與植物抗逆等性能的關系目前尚不清楚，尚待進一步調(diào)控和作用機制研究。

［1］ Liberek K，Lewandowska A，Zietkiewicz S.Chaperones in control of protein disaggregation［J］.EMBO Journal，2008，27：328-335.

［2］ Yan J，Wang J，Zhang H.A 14-3-3-interacting，ankyrin repeat-con taining protein p lays a role in both disease resistance and antioxidation metabolism［J］.Plant Journal，2002，29：193-202.

［3］ Mullen R T，Trelease R N.The sorting signals for peroxisomal memb rane-bound ascorbate peroxidase are within its C-terminal tail［J］.Journal of Biological Chem istry，2000，275：16337-16344.

［4］ Shen G X，Kuppu S，Venkataramani S，et al.ANKYRIN REPEAT-CONTAINING PROTEIN 2A is an essentialmolecular chaperone for peroxisomal memb rane-bound ASCORBATE PEROXIDASE3 in Arabidopsis［J］，Plant Cell，2010，22：811-831.

［5］ Abell B M，Pool M R，Schlenker O，et al.Signal recognition particle mediates post-translational targeting in eukaryotes［J］. EMBO Jou rnal，2004，23：2755-2764.

［6］ Zhang H，Li X，Zhang Y Z，et al.Is AKR2A an essential molecular chaperone for a class of membrane-bound proteins in plants［J］.Plant Signaling&Behavior，2010，5：1520-1522.

［7］ Eugenia L，Mary S K，Cawas E，et al.Expression profiling of ascorbic acid-related genes during tomato fruit development and ripening and in response to stress conditions［J］.Journal of Experimental Botany，2009，60：663-678.

［8］ Zhang H，Wang J，A llen R D，et al.Cloning and expression of an Arabidopsis gene encoding a putative peroxisomal ascorbate peroxidase［J］.Plant Molecular Biology，1997，34：967-971.

（責任編輯：張 韻）

S 888

A

0528-9017（2015）04-0553-05

10.16178/j.issn.0528-9017.20150435

2014-12-19

浙江省蠶桑農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項 （2012C12910）；浙江省蠶桑產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團隊 （2011R50028）；家蠶基因組生物學國家重點實驗室開放課題 （sklsgb2013015）；國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術體系-現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項 （蠶桑）（CARS-22-ZJ0105）

劉 巖（1976-），女，河南人，副研究員，主要研究方向為桑蠶分子生物學。E-mail：mayanly@sina.com。

呂志強。E-mail：13958131715@139.com。

文獻著錄格式：劉巖，沈國新，計東風，等.桑樹AKR2A伴侶蛋白基因的克隆及分析 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56（4）：553-557.