納米抗體：一種新型的分子成像工具

【作者】劉維蕩，劉巍峰

上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院醫學裝備處，上海市，200437

納米抗體：一種新型的分子成像工具

【作者】劉維蕩，劉巍峰

上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院醫學裝備處，上海市，200437

納米抗體(nanobody, Nb)是存在于駱駝科血液中的一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體。以納米抗體為基礎的分子探針和放射性核素，近紅外染料，超聲微泡等相結合，被應用到多種疾病的分子成像。該文結合最近幾年納米抗體在分子成像中的應用和臨床數據，來介紹它作為一種新型的分子成像工具在疾病診斷中的應用及未來發展方向。

納米抗體；診斷檢測；分子成像；癌癥

0　引言

隨著疾病早期快速診斷的需求越來越強烈，分子成像技術成為當前最熱門的研究領域，在疾病的診斷、臨床的醫療實踐中都是不可或缺的工具[1-2]。在過去十幾年里，分子成像技術已經有了長足的發展，各種檢測手段不斷出現，如計算機斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層掃描(PET)、單光子發射計算機斷層攝影(SPECT)、光學成像、超聲成像(USI)，研究人員現在可以利用這些成像手段監測生物體體內的各種動態變化過程[1-4]。

無論采用何種成像技術，分子成像通常都需要利用探針將示蹤分子(如放射性核素，近紅外染料，微泡等)輸送到靶標，來達到組織成像的目的。人們利用具有特異性靶向目標靶分子的探針[4]，如抗體[19]、多肽[5]、小分子配體[6]、核酸適配體(aptamers)[7]等，作為載體將放射性核素、超聲成像微泡等運送到靶標，從而使病灶迅速積累信號，快速成像。其中單克隆抗體和工程抗體在分子成像中的潛力最大，但單克隆抗體分子量大，體內代謝緩慢，高免疫原性等，限制了其在分子成像中的應用，而工程抗體[11]，如Fab、scFv、人源化抗體、嵌合型抗體等[4,8-9]，在分子穩定性，抗原的親和力和特異性方面仍然不理想。

1993年，納米抗體首次以一個新的抗體種類在Nature雜志上報道，人們發現在駱駝體內有一種特殊的抗體，它只有重鏈，缺少輕鏈，使其與抗原結合的部位只有重鏈可變區，因此被稱為單域重鏈抗體(VHH)[10]，見圖1。VHH分子質量很小，僅有15 KD，約為常規抗體的十分之一，直徑僅2.5 nm，長4.2 nm[11]，由于分子尺寸在納米級別，又被稱為納米抗體（nan°b°dy, Nb），是迄今為止自然界存在的可與抗原結合的最小片段。由于納米抗體的獨特生物學特征，使得納米抗體在疾病的分子成像方面有很大的應用潛力。因此，本文將根據最新的研究結果，來全面介紹納米抗體在疾病的分子成像方面的應用。

圖1　傳統抗體和納米抗體的結構示意圖[13]Fig.1 Structure scheme °f traditi°nal antib°dies and nan°b°dy[13]

1　納米抗體的生物學特征

1.1納米抗體的結構特征

自1993年第一次完整地報道納米抗體以來，研究人員對納米抗體的結構、功能和應用有了越來越詳細的了解。研究發現納米抗體的體積非常小，相對于單克隆抗體的6個互補決定區（CDR）（圖1），納米抗體僅有3個CDR區，但具備了抗原特異性結合能力和高親和力，具備完整的抗體功能[13]。由于分子量比較小，納米抗體的化學活性更強，具備納米級別的分子親和力，能有效的識別和結合一些結構性抗原表位。

納米抗體的二級結構是由兩個β折疊片段形成支架結構，三個CDR區集中在一側參與抗原的識別與結合。納米抗體的重鏈可變區（VHH）和傳統抗體的單域可變區（VH）結構十分相似，但是通過對比發現，VHH和VH的結構有細微的差別，但其結構與功能卻有很大的差異，見圖2。

圖2　VH 與 VHH 結構示意圖[11]Fig.2 Structure scheme °f VH and VHH[11]

1.2納米抗體的功能特性

納米抗體獨特的分子結構，使其具有傳統抗體所不具有的一些特性。研究發現，納米抗體的重折疊能力非常強，即使暴露在極端環境下，如非常低或者非常高的PH和溫度下仍能夠維持自身結構，即使發生變性，恢復到正常環境時，可以很容易復性[11]。

傳統單克隆抗體在用于病人治療時會產生免疫原性，它會使患者產生強烈的免疫反應，對病人身體造成很大的損傷，而納米抗體由于本身分子量小，只有一個結構域，而且缺乏Fc片段，不會引起補體反應，從而使其免疫原性大為降低。而且由于納米抗體的分子量很小，從而使其能夠穿過血管壁,到達致密組織內部，如實體腫瘤等，從而能夠快速到達靶標，這使得納米抗體在疾病的診斷和治療方面有很大的優勢[6]。

此外，納米抗體易于通過基因工程技術進行改造，如構建多價或多特異性抗體相對于單克隆抗體來說更加容易，而且人們也可以根據自己的實際需求構建融合分子，如將納米抗體和功能性多肽、酶，能延長半衰期的血清白蛋白，放射性核素等結合，納米抗體作為載體將融合的分子運輸到靶標，從而使其發揮作用，這使得藥物靶向治療成為可能[10,17-22]，見圖3。

圖3　多價、多特異性納米抗體示意圖[13]Fig.3 Schematic illustrati°ns °f multivalent and multispecific nan°b°dy[13]

2　納米抗體在疾病分子成像中的應用

疾病的早期快速檢測診斷，是疾病診療過程中的重要組成部分，也是主要難題。納米抗體由于分子量小，可以注射幾個小時后就能到達靶標，并且血液清除速度快，可以高特異性地結合到靶標，使得納米抗體成為理想的分子成像探針。研究人員已經將納米抗體與PET、SPECT、光學成像和超聲成像技術相結合，用于臨床疾病快速、靈敏、定量地檢測診斷[23-24]。

放射性核素分子成像技術是現階段最主要，發展最成熟的分子成像技術，它包括SPECT技術和PET技術。納米抗體和PET成像技術結合時，需要納米抗體與合適的正電子放射性核素偶聯（如18F、64Cu、68Ga等）[24]，與其他幾種成像技術相比，PET成像技術在感光度和分辨率方面更加靈敏，使得其在過去十年里獲得了更多的普及使用[24]。而在SPECT技術成像中，納米抗體需要標記上能發射出γ射線的放射性核素（如99mTc和111In）[23]。這些γ射線可以通過專用的γ相機或SPECT檢測儀器檢測到，然后將電子信號轉化成圖像，精確定位放射性標記的納米抗體的位置。而在納米抗體的生產中，為了蛋白的純化，納米抗體帶有6 x His標簽，使得納米抗體更加容易和99mTc等核素偶聯[25-26]。

納米抗體與光學成像技術相結合是腫瘤成像中的一種新興技術，它是將納米抗體和合適的發光基團（多為近紅外染料，如IRDye800CW等）結合，來實現腫瘤成像[27]。光學成像的主要優點是設置簡單，不需要專用的檢測設備，經濟成本低，而且非常適合于研究臨床疾病的表面病變。

超聲成像是利用聲波在不同器官組織中的反射的不同而達到診斷的目的。以納米抗體為基礎的超聲微泡靶向造影劑，由于其分子量小，血管等組織穿透力強、滲透性好，靜脈注入后實際到達靶細胞的濃度高，能夠產生足夠高的信號強度，收到較為理想的顯像效果，有望研制出一種穿透力強的小型化靶向超聲造影劑[28-29]。

作為一種新的分子成像平臺，納米抗體不僅應用于腫瘤成像，而且還被應用于監測關節炎的病情發展，動脈粥樣硬化和其他炎癥疾病的分子成像[18,25-26]。本文將以一些最新的應用為例，介紹納米抗體作為分子成像工具在體內無創傷診斷中的應用。

2.1表皮生長因子受體成像

表皮生長因子受體(EGFR，又被稱為HER-1)，屬于HER激酶家族。研究發現，EGFR在人的多種腫瘤細胞中過度表達，如胰腺癌、前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌等。EGFR調控細胞分裂增殖，血管形成，它的表達受到嚴格調控，當EGFR持續激活時，會導致細胞的過度分裂，促進血管的形成，抑制細胞的凋亡[30]。因此，EGFR的表達情況被作為腫瘤檢測的指標，并且可以通過分子成像技術對EGFR高表達腫瘤進行早期診斷。

Huang等[13]將EGFR的特異性抗體 8B6的 C端的6 x His標簽和放射性核素99mTc偶聯獲得99mTc-8B6融合分子，通過SPECT成像技術檢測發現，99mTc-8B6表現出很高的EGFR特異性，可以很快地聚集在EGFR過度表達的腫瘤組織，而且納米抗體很快地被腎臟排泄掉，其在體內的半衰期僅有1.5 h，很大程度上減少了放射性核素在體內存留的時間。

V°sjan等[22]則是將EGFR的特異性抗體7D12通過對異硫氰酸去鐵胺(DF-BZ-NCS)與放射性核素68Ga偶聯，然后通過PET成像技術檢測納米抗體的藥物動力學發現，注射1 h后，納米抗體大量聚集到EGFR過表達的腫瘤組織，顯示出很高的腫瘤攝取率，而且血液清除快。Oliveira等[31]將7D12抗體與近紅外染料IRDye800CW結合，利用光學成像技術發現，注射30 min后即可被檢測到腫瘤組織，并且血液中殘留的納米抗體少，背景低。

2.2血管細胞粘附因子-1成像

血管細胞粘附因子-1(VCAM-1)在體內介導淋巴細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞、單核細胞等免疫相關細胞向血管內皮粘附。VCAM-1在非動脈粥樣硬化的動脈組織中低表達，而高膽固醇血癥則能迅速誘導VCAM-1的過表達，容易誘導發生動脈粥樣硬化[32]，這使得VCAM-1成為檢測動脈粥樣硬化的一個高度相關的靶分子。

Br°isat等[34]已經報道了利用納米抗體來進行粥樣硬化斑塊的臨床成像。研究人員將VCAM-1特異性的多種納米抗體用放射性核素99mTc標記，然后注射到粥樣硬化病變的ap°E缺陷小鼠模型中，然后利用SPECT成像。通過比對成像結果發現，其中有一個納米抗體cAbVCAM1-5在小鼠體內表現出很高的特異性，可以識別動脈粥樣硬化病變組織，并且特異性地聚集在粥樣硬化斑塊處，而且可以迅速地被腎臟清除，血液背景低。

2.3癌胚抗原成像

癌胚抗原(CEA)是胎兒發育過程中存在于胃腸道組織中的一個高度糖基化的蛋白分子。雖然在成人體內的表達量非常低，但是研究發現，CEA在多種癌細胞中是高表達的，如乳腺癌、胃癌、卵巢癌等，使得人們在過去幾十年，一直研究CEA在癌癥發生過程中的功能，及在癌癥的診斷和治療的作用[11]。

C°rtez-Retam°z° 等[19]將CEA特異性納米抗體CEA1用放射性核素99mTc標記，然后注射到人類結腸癌（LS174T）裸鼠模型中，通過SPECT技術檢測納米抗體在小鼠體內的生物分布和藥物代謝動力學，檢測結果表明，注射3 h后，納米抗體的平均腫瘤吸收率大于3%ID/g，并且低背景。但是由于納米抗體會聚集在肝臟和腎臟部位，使得納米抗體在檢測這些部位的疾病時，會受到限制。

2.4巨噬細胞甘露糖受體成像

巨噬細胞甘露糖受體(MMR)是一種巨噬細胞表達的跨膜糖蛋白，它主要負責巨噬細胞對微生物，大分子蛋白的內吞作用。據報道，某些腫瘤間充質成分，特別是在缺氧部位，MMR的表達量特別高，從而促進了血管的生成，腫瘤的轉移和免疫抑制[35-36]。因此，MMR成為了一個潛在的腫瘤標志物。

研究人員將anti-MMR的納米抗體標記上99mTc，然后注射到乳腺癌(TS/A)和肺癌(3LL-R)裸鼠模型中，SPECT/CT成像顯示，納米抗體快速定位到MMR高表達組織，并且顯示高腫瘤組織特異性[36]。然而在小鼠模型中，納米抗體大量積累在肝臟和脾臟。因此有人提出構建多價的納米抗體，從而增加抗體的特異性，減少非特異性信號，減少納米抗體的半衰期，研究表明大尺寸的多價納米抗體不會影響與腫瘤的特異性結合。

3　總結

分子成像技術的快速準確的診斷為各種疾病的治療，治療過程中的監控和治療后干預提供了基礎。而納米抗體以其分子量小，組織穿透能力強，半衰期短等特點，被作為一種新型的分子探針應用到腫瘤，炎癥等疾病的分子成像，并且發展出了一套完整的診斷方法。隨著納米抗體成像技術的不斷完善，它將能夠快速診斷出不同類型、不同階段的腫瘤和其他疾病，并且可以根據病人的個體差異，而實行差異化治療。然而新的分子探針真正走向臨床，仍然面臨著許多挑戰，如政府監管，潛在市場有限，受到其他分子成像探針的挑戰等。但是大量的實驗結果證明，納米抗體在分子成像方面將會有很大的應用潛力，這使得納米抗體將會在未來的臨床診斷當面發揮重要作用。

納米抗體在疾病的分子成像方面的應用只是它很小的一個方面，它在疾病的治療，食品安全，環境防治方面都有著很大的應用潛力，相信隨著跨學科的合作，納米抗體將會給人類社會帶來更多的便利。

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Nanobody: a Novel Molecular Imaging Tool

【 Writers 】LIU Weidang, LIU Weifeng Medical Equipment Department, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 200437

【 Abstract 】Nanobodies are derived from the variable domain of the heavy-chain antibodies (HCAbs) that occur naturally in the serum of camels. Using nanobody-based probes, several imaging techniques such as radionuclide-based, optical and ultrasound have been employed for visualization of target expression in various disease models. Combined with application and clinical data of nanobody in molecular imaging in recent years, this paper introduces its application in the diagnosis of diseases and the future development as a novel molecular imaging tool.

nanobody, diagnosis and detection, molecular imaging, cancer

Q819

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.06.010

1671-7104(2015)06-0423-04

2015-09-24

劉維蕩，E-mail: 1738290396@qq.c°m