實時熒光PCR檢測HMGN5基因mRNA在肺癌組織中水平及臨床價值

蔣志強　郝長城

[摘 要] 目的：研究HMGN5基因mRNA在肺癌組織中表達。方法：選取80例肺癌患者與80例非肺癌患者（對照組）的肺組織標本，測定其HMGN5基因轉錄的mRNA水平進行比較，并分析不同病理類型和臨床分期之間的HMGN5mRNA含量差異。結果：肺癌組標本中HMGN5基因轉錄的mRNA水平顯著高于對照組（P<0.05）；各病理分型肺癌組織中HMGN5的mRNA含量間沒有顯著性差（P>0.05）；TNM分期Ⅰ期II期的肺癌組織中HMGN5基因轉錄的mRNA含量明顯低于Ⅲ期和Ⅳ期（P<0.05）。結論：HMGN5在肺癌組織中的表達顯著增高，且臨床分期提高，基因表達水平提高，提示HMGN5與肺癌的發生和發展可能存在關聯。

[關鍵詞] HMGN5；肺癌；mRNA水平；相關性研究

中圖分類號：R734.2 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2015）02-058-03

DOI：10.11876/mimt201502022

肺癌是危害人類健康惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肝癌，非小細胞肺癌約占所有肺癌80%，其5年總生存率僅為15%左右 [1]。隨著分子生物學水平研究開展，分子診斷技術作為組織病理學和影像學檢查補充策略，不僅可輔助肺癌早期診斷，還能協助判斷其發展趨勢、判斷預后，為分子靶向治療提供依據[2]。高遷移率族（high mobility group，HMG）蛋白是在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有較高遷移速率蛋白家族，包括：HMGA、HMGB和和HMGN。HMGN是一類與核小體結合核蛋白，其作用是調整染色質結構從而增強其轉錄和復制[3]。HMGN5又稱核小體結合蛋白1（NSBP1），僅在特定組織細胞內表達，其在胞質內定位和含量高低與細胞增殖周期有關，而肺癌中惡性增殖細胞周期調控機制異常。本研究通過實時熒光定量PCR方法測定肺癌組織中HMGN5基因mRNA水平，探討其對肺癌發生和發展影響，為肺癌診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年10月至2013年10月我院確診80例肺癌患者（肺癌組）以及同期疑為肺組織惡變但病理檢查陰性80例非肺癌患者（對照組）為研究對象。肺癌組：男54例，女26例；年齡42～81歲，平均（56.8±7.6）歲；組織病理分型：腺癌24例，鱗癌54例，大細胞癌2例；TNM分期：Ⅰ期9例， Ⅱ期15例， Ⅲa期16例， Ⅲb期19例， Ⅳ期21例；無轉移者34例，有局部淋巴結轉移者31例，有遠處轉移者15例。對照組：男42例，女38例；年齡33～76歲，平均（53.5±9.6）歲；疾病類型：肺部感染27例，慢性支氣管炎24例，肺氣腫16例，肺結核10例，肺纖維瘤2例，縱膈腫瘤1例。對照組患者經臨床或組織病理檢查證實肺組織無惡變且排除有肺癌家族史者。

1.2 方法

提取RNA： 取直徑約4mm組織研磨，離心后去上清，加入1mL Trizol，靜置10min后加300μL氯仿抽提；離心后取上清用異丙醇沉淀10min，離心后取沉淀；使用75%乙醇洗滌沉淀，離心取沉淀，室溫干燥；加入RNA-free去離子水溶解沉淀，測定OD260：OD280，計算RNA含量。逆轉錄PCR：取RNA2μg ，依次加入1μL Oligo （dT）、DEPC水，混勻后離心，70℃變性10min后立即放入0℃冰水中冰浴5min，計算出M-MLV以及底物量，將底物、引物和酶與逆轉錄液混勻，設置好PCR參數，逆轉錄出cDNA用于Real-time PCR反應：95℃預變性2min，然后95℃15s～60℃1min循環45次，最后95℃變性1min后冷卻至55℃，讀取Ct值，計算出RNA相對表達量。

1.3 評價指標

每個標本讀取兩次循環閾值（Ct值）后取平均值，ΔCt值以標本中HMGN5基因Ct值減去對照組基因Ct值，ΔΔCt為肺癌組織HMGN5基因ΔCt值減正常組織HMGN5基因ΔCt值。以2-ΔΔCt表示肺癌組織中HMGN5基因相對含量，當2-ΔΔCt>2認為該基因表達水平高。比較肺癌組和對照組病理組織中HMGN5基因轉錄mRNA水平（以2-ΔΔCt表示）。比較不同病理類型、不同臨床分期肺癌組織中HMGN5轉錄水平。

1.4 統計學方法

使用SPSS18.0統計軟件對實驗采集數據進行分析，數值變量資料用x±s表示，組間采用配對樣本資料t檢驗；無序分類變量資料用n%表示，采用獨立樣本R×C列聯表資料χ2檢驗。均以α=0.05為檢驗水準，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組和對照組mRNA水平

肺癌組患者標本中HMGN5基因轉錄mRNA水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），數據見表1。

2.2 病理類型及分期與mRNA水平

對各病理類型肺癌組織中HMGN5基因轉錄mRNA含量進行兩兩比較，經檢驗，差異無統計學意義（P>0.05）數據見表2。

TNM分期Ⅰ期肺癌組織中HMGN5基因轉錄mRNA含量明顯低于Ⅲ期和Ⅳ期，差異有顯著性（P<0.05）。Ⅱ期肺癌組織中雖然ΔCt 明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期，但2-ΔΔCt 經t檢驗分析差異統計學意義（P>0.05）。

3 討論

肺癌發生發展生物學過程十分復雜，目前其分子機制研究發現肺癌發生主要與原癌基因激活和抑癌基因抑制相關，隨著研究進一步深入，其他與肺癌相關基因作用和機制也得到一定闡述[4]。HMG蛋白是動物細胞核內除組蛋白外含量最豐富蛋白質之一，HMGN通過與核小體動態結合從部分或總體上對細胞內染色質結構進行適當調整，已有不少報道稱這一作用可能對腫瘤發生及發展有相關影響[5]。

HMGN5即NSBP1，其基因全長為8600bp ，由6個外顯子、5個內顯子及非編碼區構成，其cDNA序列全長1865 bp [6]。HMGN5結構特點對其生物學作用有著重要意義，其正確空間結構是與連接體組蛋白H1競爭結合核小體基礎，可減弱后者對核小體穩定作用從而使染色體結構快速解聚。HMGN家族因分子質量小具有高度流動性，在沿著細胞核持續流動過程中隨機地與核小體結合，與之結合成復合體后，高度有序染色體結構復雜性被降低，從而影響DNA轉錄和修復[7]。

HMGN5 蛋白分布具有一定組織器官特異性并且隨個體生長發育發生改變，在幼兒腦和肺組織中并未檢測出其表達，但在成人肝、腎、胰腺及骨髓中均有一定水平表達。雖然HMGN5作用具體分子機制尚未完全得到證實，但已有學者報道HMGN5蛋白在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等組織中表達水平增高，HMG基因重排、斷裂與神經膠質瘤、胃腸道腫瘤、女性生殖系統腫瘤以及脂肪瘤等腫瘤發生有關[8]。研究報道[9]稱抑制HMGN5表達后，前列腺癌細胞活性降低，且G2/M+S期細胞數目明顯下降，這一過程可能與HMGN5參與cyclinB1等細胞周期蛋白調控有關，但目前關于HMGN5基因在肺癌中作用相關報道還比較少。

本次研究結果表明肺癌細胞中HMGN5基因mRNA轉錄水平顯著增高（P<0.05）；肺癌臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期者組織中HMGN5基因表達水平較早期顯著升高（P<0.05），但不同病理分型肺癌組織中HMGN5mRNA含量間沒有顯著性差（P>0.05）。陳鵬等 [10]使用反義RNA干擾mRNA表達，通過構建小干擾RNA（siRNA）慢病毒表達載體沉默HMGN5基因，結果顯示被慢病毒感染后細胞HMGN5mRNA轉錄水平顯著降低，被感染細胞細胞周期中在G0進入G1期時發生阻滯，提示HMGN5沉默可顯著抑制肺癌細胞分裂增殖，因而認為HMGN5表達參與了惡性腫瘤發生和進展。閻紅娥等[11]研究結果發現非小細胞肺癌中HMGN5陽性率較癌旁組織明顯升高，而且其在細胞中定位與細胞進行新陳代謝和增殖關鍵部位相關，該實驗還發現隨著肺癌進展，HMGN5表達逐漸呈增高趨勢，與本次研究結果相似。作者認為HMGN5主要通過縮短細胞周期，加速癌細胞分裂增殖從而促進肺癌發展。

綜上所述，HMGN5基因在肺癌組織中有較高轉錄水平，且隨著疾病進展，其表達水平逐漸升高，為肺癌分子靶向治療提供了新思路，可能成為抗肺癌分子治療策略作用新靶點。

參 考 文 獻

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