高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方仙靈脾膏中淫羊藿苷的含量

何培根　劉菁

[摘 要] 目的：建立測(cè)定復(fù)方仙靈脾膏中淫羊藿苷含量的液相色譜法。方法：采用FORTIS-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈：0.05%磷酸二氫鉀溶液（21：79）為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。結(jié)果：淫羊藿苷在0.034～0.680mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系（r=0.9998），平均加樣回收率為98.2%，RSD為0.97%。結(jié)論：本方法靈敏度高、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可作為控制復(fù)方仙靈脾膏質(zhì)量的重要方法。

[關(guān)鍵詞] 淫羊藿苷；復(fù)方仙靈脾膏；離子對(duì)色譜法

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）02-070-03

DOI：10.11876/mimt201502026

復(fù)方仙靈脾膏為原衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第15冊(cè)（WS3-B-2942-98）收載復(fù)方仙靈脾酒，由于高血壓患者不宜服用藥酒，特別是有些服用其他藥物患者不能同時(shí)飲酒。我院中醫(yī)科臨床結(jié)合患者需求將復(fù)方仙靈脾酒改變劑型為復(fù)方仙靈脾膏。本方由淫羊藿150g、枸杞子200g、丹參150g組成。具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕。用于腰膝酸軟，四肢麻痹，神疲健忘[1]。原復(fù)方仙靈脾酒標(biāo)準(zhǔn)中只有鑒別和檢查項(xiàng)，缺乏對(duì)制劑中藥材定量控制，無(wú)法對(duì)制劑原料藥材進(jìn)行品質(zhì)管控，無(wú)法控制成品內(nèi)在質(zhì)量。為更好控制本制劑質(zhì)量，筆者以方中淫羊藿為控制藥材，以其主要藥效成分淫羊藿苷（Icariin）作為定量分析指標(biāo)，建立了復(fù)方仙靈脾膏定量分析方法，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿具有免疫調(diào)節(jié)與延緩衰老作用，具有促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成、防治骨質(zhì)疏松作用[2]。其主要成分有黃酮類化合物、木脂素、生物堿、揮發(fā)油等.其中黃酮類化合物淫羊藿苷為其主要藥理活性物質(zhì)及其質(zhì)量控制指標(biāo)成分[3]。中國(guó)藥典也將其作為含淫羊藿制劑主要質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)定物[4]。

本文采用HPLC法對(duì)不同批次復(fù)方仙靈脾膏中淫羊藿苷含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：本法靈敏度高、重復(fù)性好， 結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試劑

Dionex-U3000液相色譜儀（Dionex公司，Dionex Chemeleon色譜工作站）；Mettler Toledo MS104S型電子天平（d=0.01mg，瑞士Mettler Toledo）公司；SK40-360超聲波清洗機(jī)（神科電子超聲有限公司）；淫羊藿苷對(duì)照品（供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批110737-200415）；乙腈（天津大茂，色譜純）；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥至恒重淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.68mg溶液即得。

2.2 供試品制備

取本品5.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加硅藻土3g，拌勻，精密加入50%乙醇50mL，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，離心處理10min（10000r/min），精密吸取上清液25mL，水浴蒸干，殘?jiān)?0%乙醇完全轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。按上述方法制得不含淫羊藿陰性對(duì)照溶液。

2.3 色譜條件

采用以乙腈：0.05%磷酸二氫鉀溶液（21：79）為流動(dòng)相[5-6]，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，在此色譜條件下，淫羊藿苷色譜峰理論板數(shù)不小于3000，分離度大于1.5。其色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL、10.0mL分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋，并定容至刻度，搖勻，得到濃度分別為0.034 mg/mL、0.068 mg/mL、0.136 mg/mL、0.340 mg/mL、0.544 mg/mL、0.680mg/mL淫羊藿苷對(duì)照品溶液。分別精密吸取10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以濃度（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=116.2294X-2.6741，r=0.9998；結(jié)果表明淫羊藿苷在0.034～0.680mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取淫羊藿苷對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件，進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果淫羊藿苷色譜峰保留時(shí)間穩(wěn)定，計(jì)算6次峰面積RSD為1.32%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取復(fù)方仙靈脾膏供試品溶液，室溫下分別在0h、3h、6h、12h、24h進(jìn)樣測(cè)定，記錄淫羊藿苷色譜峰面積，計(jì)算其RSD為1.48%，表明處理后復(fù)方仙靈脾膏供試品溶液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批復(fù)方仙靈脾膏樣品（批號(hào)20131206）6份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷平均含量為0.62mg/g，RSD為1.65%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)已測(cè)定含量復(fù)方仙靈脾膏樣品（批號(hào)20131206）9份，每份2.5g，精密稱定，分別加入淫羊藿對(duì)照品溶液（濃度0.68mg/mL）1.0mL、2.0mL、3.0mL（3種不同水平，各3份），按上述方法同法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL。按外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算淫羊藿苷含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

復(fù)方仙靈脾膏中，枸杞子用量為200g為最大。中國(guó)藥典對(duì)枸杞子質(zhì)量控制為測(cè)定總多糖和用薄層色譜掃描法測(cè)定甜菜堿含量。對(duì)于本復(fù)方制劑而言，煎膏劑中含有大量蔗糖輔料，測(cè)定多糖無(wú)法控制藥材具體投放量。而薄層色譜法進(jìn)行含量測(cè)定操作繁瑣，且誤差較大，無(wú)法嚴(yán)格控制原料與工藝穩(wěn)定性，因而筆者選擇淫羊藿中淫羊藿苷作為本方定量控制指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)供試品制備方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用硅藻土拌，主要是由于煎膏黏性太大，超聲無(wú)法完全分散溶質(zhì)。

筆者還對(duì)原料淫羊藿藥材進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果其淫羊藿苷含量為0.64%。經(jīng)計(jì)算，復(fù)方仙靈脾膏在制備過(guò)程中，其淫羊藿苷提取率為70.53%，說(shuō)明復(fù)方仙靈脾膏制備工藝合理，能充分保證有效成分提取率。今后將進(jìn)一步提高制備工藝水平，保證制劑質(zhì)量進(jìn)一步提高和制備工藝穩(wěn)定性。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).WS3-B-2942-98中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998.

[2] 曾慶岳，王云山.淫羊藿藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（4）：462-465.

[3] 李梨，周岐新，石京山.淫羊藿苷藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2005，16（12）：952-954.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：306.

[5] 鄧祖磊，崔田.HPLC法測(cè)定金剛片中淫羊藿苷含量[J].中國(guó)藥房，2012，23（48）：4585-4586.

[6] 趙明宏，韓鐫竹，王常麗，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方仙靈脾顆粒中淫羊藿苷和丹參酮ⅡA含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（1）：63-65.