固酶氮摻雜碳納米復合物基燃料電池性能

庫里松哈衣爾別克 趙淑賢 楊 陽 曾 涵

(新疆師范大學化學化工學院, 烏魯木齊 830054)

固酶氮摻雜碳納米復合物基燃料電池性能

(新疆師范大學化學化工學院, 烏魯木齊 830054)

利用摻雜氮介孔材料(NDMPC)和羧甲基殼聚糖(CMCH)機械共混的納米復合物作為固酶載體, 以滴涂-干燥法分別制備了固定漆酶(Lac)陰極和固定葡萄糖氧化酶陽極, 組裝了有Nafion離子交換膜的葡萄糖/O2酶燃料電池. 固定漆酶電極作為燃料電池陰極和氧電化學傳感器的性能以結合旋轉圓盤電極技術的循環伏安法、線性掃描伏安(LSV)法以及計時電流法進行表征, 同時使用紫外-可見分光光度法和石墨爐原子吸收光譜法研究酶分子在電極表面的構型和估算電極表面載體對酶的擔載量. 測試結果表明: 固酶陰極在無電子中介體時可以實現漆酶活性中心T1與導電基體之間的直接電子遷移(表觀電子遷移速率為0.013 s–1), 而且具有較小的氧還原超電勢(150 mV). 通過進一步定量比較分子內電子傳遞速率(1000 s–1) 、底物轉化速率(0.023 s–1)以及前述酶-導電基體間電子遷移速率, 可以發現此電極催化氧還原循環受制于酶-電極之間的電子遷移過程; 這種電極對氧的傳感性能良好: 低檢測限(0.04 μmoldm–3)、高靈敏度(12.1 μAμmol–1dm3)和良好的對氧親和力(KM= 8.2 μmoldm–3), 這種固酶陰極還具有良好的重現性、長期使用性、熱穩定性和pH耐受性. 組裝的生物燃料電池的開路電壓為0.38 V, 最大能量輸出密度為19.2 μWcm–2, 最佳工作條件下使用3周后輸出功率密度仍可保持初始值的60%以上.

漆酶; 氮摻雜介孔碳材料; 羧甲基殼聚糖; 直接電子遷移; 氧還原反應; 電化學傳感器;生物燃料電池

1 引 言

漆酶(Laccase, 簡稱為Lac)由于具有較高催化氧還原活力從而成為當前研究最多的一種酶燃料電池陰極催化劑,1–3但Lac的活性中心結構過于復雜,難以實現酶-電極間直接電子導通,4,5目前所見的能夠實現酶-電極間有效電子導通的方式包括: 使用電子中介體6,7和依靠疏水–疏水作用將酶活性中心與帶大π鍵共軛體系官能團修飾的納米器件定向連接,以實現酶-導電基體之間的直接電子遷移.8–10此外使用氧化還原聚合物水凝膠作為誘陷酶的載體也是非常有效地實現酶-電極間直接電子導通的手段.11,12但是以上這些方法都存在一些缺陷: 使用電子中介體會降低電池的輸出能量密度, 某些中介體對人體有毒副作用且易變性, 長期使用性能較差;6制備氧化還原水凝膠需要使用貴重金屬, 制備工序復雜且成本高, 對生物體和環境都不友好;11,12此外文獻報道的多數實現酶-電極間直接電子遷移的固定Lac基電極在沒有底物存在的條件下觀察不到表征酶活性中心發生電子得失的電信號, 因此不利于分析電極上催化反應動力學.8,9介孔納米材料主要包括近年來受到關注的介孔硅納米材料13以及摻雜氮的介孔碳納米材料14由于具有較高的導電能力和比表面積、可調節的多孔結構和孔徑以及良好的對生物分子親和力等優勢, 成為制備固酶載體的適宜候選對象. 介孔材料表面存在很多親水基團以及突出于表面的孤立芳香環等功能化基團, 當其與酶分子接觸時, 這些突出于表面的芳香環可深入酶活性中心附近而且親水基團易于和電極表面的功能基團化學鍵合, 不但利于穩固地將酶分子固定在載體表面,而且憑借酶的活性中心附近疏水結合位與載體表面修飾的疏水芳香性基團之間的作用12,15或依靠載體表面功能化基團作為配體與酶活性中心的金屬離子之間的作用, 從而實現酶-電極之間的直接電子遷移.16,17另一方面, 介孔材料表面的親水基團使之更易于在水溶液中分散, 這樣就可以避免載體固定的酶分子團聚, 從而降低酶的催化活力.18但是介孔納米材料仍然存在一個缺陷, 即難以在基底電極表面形成均勻、穩定的修飾層, 因此需要另一種成膜劑與之復合才可以制備性能穩定的固酶電極. 殼聚糖及其衍生物具有黏度高, 成膜性和延展性好, 成膜穩定性高, 機械強度較高且對生物分子的生物兼容性較好6等優點, 因此適合作為成膜劑, 但是殼聚糖及其衍生物本身并不導電. 如果將具有導電能力的摻雜氮介孔碳材料與具有良好成膜性的殼聚糖衍生物機械共混后便可得到既能實現酶-電極間的有效電子導通又具有良好力學穩定性的固酶修飾電極. 文獻已有摻雜氮碳納米管固定Lac電極作為酶燃料電池陰極性能研究的相關報道,14但并沒有研究此類電極的直接電子遷移性能, 也沒有對整個電極催化反應動力學進行定量分析; 此外固酶過程中額外化學試劑的加入可能影響了酶的催化性能;19前文20獲得了一種基于將殼聚糖與摻雜氮介孔碳材料機械共混所得納米復合物固定Lac電極, 雖然可以實現酶-電極之間的直接電子遷移, 但此電極的力學穩定性較差, 因此無法進一步研究其催化反應動力學, 也沒有測試基于這種電極組裝的酶燃料電池的性能. 基于文獻和前文所得結論, 本文以具有更高親水性和成膜性的羧甲基殼聚糖與摻雜氮介孔碳材料機械混合所得納米復合物作為載體, 制備了固酶修飾電極, 考察了這類固酶電極的直接電化學行為, 催化底物反應性能以及對氧的電化學傳感性能, 分析了Lac催化氧還原反應的動力學并確定了制約催化過程的關鍵因素. 在此基礎上組裝了固酶葡萄糖/O2燃料電池, 評估了電池的能量輸出性能和長期使用性. 本文所得結果為設計高性能固酶電極/酶燃料電池和研究酶燃料電池的構效關系提供了實驗依據和研究基礎.

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

葡萄糖氧化酶(GOx, 分子量～50000), 云芝漆酶(Lac, 分子量68000), 現買現用無需進一步純化, 以及2,2'-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二胺鹽(純度: 98.5%, ABTS), 二茂鐵甲酸(純度: 98.0%, FMCA)均購自美國Sigma化學試劑有限公司; SBA-15介孔分子篩, 聚四氟乙烯透析膜(孔徑0.2 μm)和銦錫氧化物(ITO)玻璃片均購自南京先鋒納米材料科技有限公司; 殼聚糖(脫乙酰度 ≥ 90%, 分子量250000, 簡寫為CTS), 羧甲基殼聚糖(脫乙酰度 ≥95%, 羧甲基接枝率 ≥ 80%, 分子量265000, 簡寫為CMCH)均購自上海生藥生物科技有限公司; 乙二胺, CCl4, HF, 乙醇, 氫氧化鈉, 異丙醇, 氯乙酸, HAc, K3Fe(CN)6, K4Fe(CN)6, 甲醇, KCl, 丙酮, 檸檬酸三鈉, KH2PO4等試劑均為分析純; 實驗中使用的緩沖溶液為0.2 moldm–3的磷酸鹽緩沖液(縮寫為PBS), 溶液pH值通過改變KH2PO4和檸檬酸三鈉的濃度比例來調控; 所有溶液均用Milli-Q超純水配制. 其他試劑如未特殊說明均為分析純, 實驗中用到的N2, O2(5N)購自南京特氣. 2K15型高速離心機(德國Sigma公司); 掃描電鏡照片以JSM-6700F型場發射掃描電子顯微鏡(SEM, 日本電子公司JEO, 加速電壓: 0.5–30 kV)拍攝, 樣品制備系摻雜氮介孔碳材料的分散液(pH = 6.0的PBS緩沖液為分散劑)滴涂在銅網基底上真空干燥制得; Analyst 800型原子吸收光譜儀(美國Perkin-Elmer公司, 主機: 雙光束火焰/石墨爐原子吸收分光光度計, 光譜范圍: 190–870 nm); U-2810型紫外-可見分光光度計(日本島津公司, 比色皿厚度1 cm); CHI-1140A型電化學分析儀(上海辰華儀器有限公司), AFMSRCE型旋轉圓盤電極系統(美國Pine公司, 電極轉速v = 50–10000 rmin–1); 作為參比電極的Ag/AgCl(飽和KCl)電極和作為工作電極的玻碳電極(GC, 直徑6 mm)均購自天津艾達恒晟工貿有限公司, 對電極為鉑絲電極, 自制.工作電極使用前先以3500#砂紙, 1.0和0.5 μm氧化鋁粉漿拋光, 再用丙酮和三次重蒸水超聲清洗各2次,每次2 min. 文中如無特殊說明, 所有的電極電位均為相對于NHE(標準氫參比電極)而言.

2.2 摻雜氮介孔碳納米復合物固酶電極的制備

摻雜氮介孔碳材料按照文獻21報道方法制備.方法簡述如下: 將1.35 g乙二胺和3 g四氯化碳充分混合后, 向其中加入1.6 g煅燒過的SBA-15介孔分子篩并磁力攪拌10 min. 然后在90 °C磁力攪拌回流6h發生較為復雜的縮合反應生成高分子模板碳氮化物, 經聚四氟乙烯透析膜過濾獲得的深棕色混合物放在真空干燥箱中, 于0.08 MPa表壓, 65 °C條件下干燥12 h, 將干燥過的固體在研缽內碾為細粉. 將其置于高溫反應爐中于氮氣保護(N2流速: 50 mLmin–1)氣氛中以3 °Cmin–1升溫速率加熱至600 °C,并在600 °C下加熱處理5 h直至模板碳化為止. 以質量分數(w)為5%的HF溶液溶解硅骨架之后回收得到介孔碳的氮化物, 以無水乙醇沖洗3次后放入干燥箱中于100 °C下干燥處理10 h后就得到摻雜氮介孔碳材料的成品, 縮寫為NDMPC.

(1)稱取100 mg CMCH加入10 mL pH = 6.0的PBS中, 磁力攪拌2 d可以得到CMCH的PBS溶液, 隨后移取3 mL此溶液向其中加入NDMPC 10 mg, 超聲共混30 min后得到分散均勻的黑色懸浮液; (2)向懸浮液中加入6.5 mg Lac或4.0 mg GOx粉末并磁力攪拌1 h, 隨后放入冰箱中于4 °C下儲存過夜; (3)將固酶復合物取出在8000 rmin–1轉速下離心15 min,倒去上清液后用少量PBS清洗固酶復合物2次, 按同樣條件離心沉降, 移除上清液后便可得到固酶復合物; (4)移取50 μL固酶復合物滴涂到GC上, 于室溫下干燥, 得到固酶復合物修飾電極, 分別標記為Lac/ CMCH-NDMPC/GC和GOx/CMCH-NDMPC. 作為對比電極的NDMPC-CTS納米復合物固定Lac電極的制備方法類似于Lac/CMCH-NDMPC/GC, 只是成膜劑為CTS, 溶劑為10 mL質量分數為1.5%的HAc溶液, 此電極記為Lac/CTS-NDMPC/GC. 固酶復合物擔載酶的質量和固酶催化比活力按照文獻17,22給出的方法進行測定.

2.3 固酶納米復合物的表征

固酶納米復合物的形貌以掃描電鏡進行表征.紫外-可見分光光度法測定固定Lac納米復合物UVVis吸收光譜的具體方法如下: 將Lac溶解于PBS中得到5.0 × 10–2gcm–3的溶液(游離Lac), 倒入比色皿中進行紫外-可見吸收光譜測定, 將Lac溶解在CTS質量分數(w)為3%的乙酸溶液(乙酸的質量分數為1.5%)中后, 得到Lac濃度為5.0 × 10–2gcm–3的混合液, 移取此混合液200 μL均勻地涂覆在ITO玻璃片上使其在空氣中室溫干燥, 最后插入比色槽中進行Lac-CTS復合物的UV-Vis測定; 而固定Lac的NDMPC-CTS或CMCH復合物則是按2.2節方法分別制備, 隨后分別移取兩種復合物各200 μL均勻地涂覆在ITO玻璃片上使其在空氣中室溫干燥, 最后插入比色槽中進行測定.

2.4 納米復合物固酶電極的直接電化學

以循環伏安(CV)或線性掃描伏安(LSV)法結合旋轉圓盤電極技術研究了Lac/CMCH-NDMPC/ GC的直接電化學行為及催化氧還原性能, 所有電化學測試在常規三電極電解池中進行. 以Lac/CMCHNDMPC/GC作為工作電極, PBS緩沖液(pH = 4.4)作為電解質溶液, 研究固酶電極直接電化學行為實驗中, 實驗前先向溶液中鼓泡通入N2除氧至少30 min,測試過程中電解液上方通入N2使溶液保持N2氣氛.在氧還原實驗中, 實驗前先向PBS緩沖液中不斷鼓泡通入高純O2至少15 min使溶液為氧氣飽和, 實驗中還不斷向電解液上方通入O2使溶液上方維持O2氣氛, 所有測定均是在(25.0 ± 0.4) °C下進行. 文中給出的電流密度以電極的活性表面積進行歸一化處理. 活性表面積按照文獻23給出的方法標定. 實驗測定CMCH-NDMPC/GC的實際活性表面積為0.50 cm2(參見圖S1 (Supporting Information)).

2.5 納米復合物固酶電極作為氧電化學傳感器的性能評估

用計時電流法(CA)評估Lac/CMCH-NDMPC/ GC對氧氣的傳感性能. 計時電流曲線系固酶電極在含有一系列不同O2濃度的PBS溶液中(pH = 4.4)于恒定電壓下記錄響應還原電流–時間關系曲線而得到,這一系列不同O2濃度的PBS溶液是向為N2氣飽和的PBS溶液中加入不同體積的空氣飽和PBS溶液而制得(溶液中氧氣濃度大約是260 × 10–6moldm–3), 氧還原電位參考文獻6方法, 以出現極限擴散電流的電位作為工作電位.

2.6 納米復合物固酶基生物燃料電池的組裝和性能測試

構筑固定GOx的陽極GOx/CMCH-NDMPC和固定Lac的陰極Lac/CMCH-NDMPC/GC, 放入一個玻璃制兩極室電池中, 以全氟化離子交換膜(Nafion 115, 厚度0.125 mm)作為隔膜將陽極室和陰極室(體積各為10 mL)分隔開. 兩個極室上方各有一個進氣口, 以導氣管與氣源連接, 陽極電解液為1 mmoldm–3的除氧葡萄糖PBS緩沖溶液(pH = 6.0). 為了提高燃料電池輸出功率, 需要改善陽極GOx與電極之間的電子遷移性能, 因此在陽極電極液中加入FMCA為電子中介體, 其濃度恒定為0.5 mmoldm–3,陽極室上方維持氮氣氣氛; 而陰極室則充入氧氣飽和的PBS緩沖溶液(pH = 6.0), 加入的電子中介體為ABTS, 濃度恒定為1.0 mmoldm–3, 陰極室上方維持氧氣氣氛. 電阻值范圍在0–100 kΩ的外加負載與組裝的兩個電極相連接, 籍調節負載的電阻值調控電池的輸出電壓和輸出電流密度.

3 結果與討論

3.1 固酶納米復合物的表征

圖1為NDMPC和固定Lac的CMCH-NDMPC納米復合物的掃描電鏡照片. 從圖1可以看出, 固酶前的NDMPC表面比較粗糙且具有三維結構, 呈片狀分布, 每一個片狀NDMPC表面上有許多細小的微孔, 孔徑均一且都小于10 nm. 這表明NDMPC的規則碳基骨架結構一方面提供了良好的電子通道, 同時各有序結構之間直徑小于10 nm的孔道也給小分子底物和產物提供了良好的傳質通道. 固酶納米復合物的形貌則與NDMPC有很大區別: 海綿狀的NDMPC在與CMCH充分混合并固定了Lac后, 形成了較為均勻的薄膜, 表明三者之間分散混合性良好,而且薄膜表面存在許多微孔和縫隙, 利于氧氣分子滲透進入納米復合物內部并和其中誘陷的Lac分子接觸發生反應, 其表面的突起塊狀物可能是納米復合物表面的Lac分子依靠分子間作用力形成的團聚物. 圖2給出了游離Lac, Lac-CMCH, Lac/NDMPCCTS以及Lac/NDMPC-CMCH的紫外-可見吸收光譜. 從圖2可以看出, 游離Lac在605 nm附近出現一個很強的吸收峰, 對應于Lac氧化還原活性中心T1中心銅離子(氧化態)的d-d配位躍遷, 與文獻24報道的結果一致. 此吸收峰可以歸屬于Lac中心Cu離子在N,O, S等雜環配位體存在時低能態d電子躍遷至高能態d軌道的d-d配位躍遷.16,20Lac-CMCH薄膜, Lac/ NDMPC-CTS以及Lac/NDMPC-CMCH在同樣的位置也有較強的吸收峰, 但吸收峰強有差異, 這種差異表明不同的載體對Lac有不同的擔載量, NDMPCCMCH復合物由于兩組分的協同效應相對于CMCH成膜劑具有更多的酶擔載量(石墨爐原子吸收法測定Lac-CMCH, Lac/NDMPC-CTS以及Lac/ NDMPC-CMCH對Lac的擔載量分別為6.4、4.3和11.3 mgg–1), 同時還表明復合物固定的Lac較好地保持了游離Lac的 T1活性位氧化態銅中心離子的原有配位構型及其活性中心的微環境. 此外對比實驗表明與多壁碳納米管直接接觸6 h的Lac則觀察不到此吸收峰而且不能催化ABTS的氧化, 即活性中心的配位構型發生了變化, 從而失去了催化底物氧化的活力; 而Lac/NDMPC-CTS或CMCH納米復合物于4 °C下靜置過夜后測定的紫外-可見吸收光譜中仍出現605 nm的特征吸收峰, 且能有效地催化ABTS的氧化(兩者對ABTS的催化比活力沒有顯著差異, 分別是1.06和0.88 Umg–1). 此結果表明NDMPC相對于碳納米管而言更利于維持所固定的酶活性位中心離子的配位構型和價態. 圖3是裸玻碳電極(GCE), CMCH-NDMPC/GC以及Lac/CMCHNDMPC/GC在0.5 mmoldm–3K3Fe(CN)6和0.1 moldm–3KCl支持電解質溶液中的CV曲線. 從圖3可以看出: 當電極表面覆蓋一層CMCH-NDMPC復合物后, 相對于裸玻碳電極(ΔEP= 60 mV), 陰陽極峰電流明顯增加而峰電位差(ΔEP= 65 mV)幾乎沒有明顯變化, 中值電位正移了80 mV左右, 這表明納米復合物在沒有改變電極反應準可逆性的同時增加了電極表面的活性表面積, 促進了K3Fe(CN)6在納米復合物修飾電極表面的氧化還原; 而Lac/CMCHNDMPC/GC的陰陽極峰電流與前兩個電極相比更高, 峰電位差(ΔEP= 65 mV)也沒有明顯變化, 這表明固定Lac的納米復合物電極在沒有改變電極反應動力學的前提下, 電子遷移的位阻進一步降低, 這表明電極表面固定的酶分子有一部分可以實現與電極表面的導電基體直接電子導通, 這一結果與文獻報道的殼聚糖-多壁碳納米管修飾玻碳電極6和固定納米金粒子的己二硫醇修飾金盤電極25在同樣體系中的情況有所不同(不能實現酶-電極直接電子遷移的酶基電極在相同體系中得到循環伏安曲線中的陰陽極峰電流急劇下降甚至消失).

圖1 NDMPC (a)和固定Lac 的CMCH-NDMPC納米復合物(b)的掃描電鏡照片Fig.1 SEM images of NDMPC (a) and CMCH-NDMPC nanocomposite with entrapped Lac molecule (b)

圖2 游離Lac的PBS (pH = 6.0), Lac-CMCH, Lac/NDMPCCTS以及Lac/NDMPC-CMCH薄膜的UV-Vis光譜Fig.2 UV-Vis spectra of PBS (pH = 6.0) containing free Lac, thin films of Lac-CMCH, Lac/NDMPC-CTS, and Lac/NDMPC-CMCH

圖3 裸玻碳電極、CMCH-NDMPC/GC以及Lac/CMCHNDMPC/GC在0.1 moldm–3KCl + 0.5 mmoldm–3K3Fe(CN)6溶液中的循環伏安(CV)曲線Fig.3 Cyclic voltammogram (CV) curves of bare glassy carbon electrode (GCE), CMCH-NDMPC/GC and Lac/CMCH-NDMPC/GC in 0.1 moldm–3KCl + 0.5 mmoldm–3K3Fe(CN)6solutionscan rate: 10 mVs–1

圖4 Lac/CMCH-NDMPC/GC分別在無氧和氧氣飽和的0.2 moldm–3無氧PBS (pH = 4.4)中的CV曲線Fig.4 CV curves of Lac/CMCH-NDMPC/GC in deaerated and oxygen-saturated 0.2 moldm–3deaerated PBS (pH = 4.4)

3.2 納米復合物固酶電極的直接電化學及催化氧還原性能

酶活性中心-導電基體之間是否發生直接電子遷移有兩個判據:26直接證據和間接證據. 直接證據就是固酶修飾電極在不含有任何底物的電解質溶液中能觀察到表征酶活性中心發生氧化還原反應的電化學信號; 而間接證據就是底物存在條件下能觀察到底物被酶電催化氧化或還原所產生的電化學信號.

圖4是固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC, 未固定Lac電極CMCH-NDMPC/GC分別在除氧的PBS溶液中以及固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和的PBS緩沖液中以相同掃描速率獲得的CV曲線. 從圖4可以看出, Lac/CMCH-NDMPC/GC的CV曲線上出現了一對峰形不很明顯的氧化還原信號, 陽極氧化與陰極還原反應的峰電位分別出現在0.74和0.54 V左右. 與之相對, 未固定漆酶的納米復合物修飾電極CMCH-NDMPC/GC在所掃描的電位區間內沒有任何可以與背景電流區分的氧化還原峰, 這表明該電極在這個電化學窗口內是非電化學活性的, 也就不會干擾固酶電極上可能出現氧化還原電信號的判定和歸屬, 根據文獻報道的結果,24,26可以推測位于這個較弱的氧化還原電化學信號與電極表面固定的Lac的活性中心T1-導電基體NDMPC之間的直接電子遷移過程相關, 但考慮到掃描速率較低的情況下峰電位差ΔEP也達到將近200 mV, 加之陰極還原信號明顯較陽極氧化信號更強, 因此這表明電極表面固定酶分子與導電基體之間電子遷移的可逆性較差. 此氧化還原信號的中值電位(大約是640 mV)與Lac活性中心T1的式電位(大約是780 mV)相差達140 mV, 這可能是由于被包埋在不導電的蛋白質骨架內部的Lac分子活性中心與導電基體的間距具有隨機性而非定向連接, 電荷在活性中心-導電基體之間的遷移需要克服較高的勢壘. 應該指出的是, 本文制備的固酶電極與文獻報道的蒽基重氮鹽吸附Lac修飾玻碳電極8,9或多壁碳納米管擔載的Lac修飾電極不同, 后者在不含任何底物的緩沖液中記錄的循環伏安曲線上沒有明顯的表征酶活性中心自身發生電子遷移的電化學信號, 從而不方便于研究電極上催化反應動力學.10要研究催化反應動力學首先需要確定導電的酶分子表面濃度, 根據圖4和圖3的結果可以粗略估算本文制備固酶電極上實現直接電子導通的酶分子表面濃度, 如前所述, 根據納米復合物電極固酶前后在K3Fe(CN)6溶液中掃描所得循環伏安曲線上氧化還原峰面積的差異Q, 以及Lac分子的橫截面積以及復合物電極的活性面積等條件間接計算得出導電酶分子表面濃度, 即固酶復合物修飾電極在電活性物種存在條件下氧化還原峰積分面積計算的反應電量等于導電酶分子占據載體部分表面積所貢獻的反應電量(由文獻22給定的單層緊密排列酶分子表面濃度和前述電極表面固酶量可以估算出這個占據面積)與未被酶分子覆蓋的導電載體面積貢獻的反應電量之和. 按這種方法粗略估算電極表面實現電子直接導通的酶分子表面濃度Γ為1.1 × 10–8molcm–2, 這一數值大大高于Lac分子在電極表面按照單分子緊密排列所得的表面濃度(4.64 × 10–12molcm–2),22這一數值相當于大約2400層緊密排列的Lac分子實現了與導電基體的直接電子導通, 這一數值遠高于文獻報道的多孔納米金固酶電極的導電酶分子表面濃度(2.1 × 10–11molcm–2),22這表明在載體擔載酶量相近(～11 mgg–1)的條件下, 本文制備的NDMPC-CMCH納米復合物固定Lac修飾電極具有更高的導電酶分子表面濃度, 即該電極相對更利于酶分子與導電基體之間的電子遷移. 但是值得注意的是, 根據圖4所示固酶電極在無底物溶液中掃描所得循環伏安曲線陰極還原峰計算所得的導電酶分子表面濃度較按照陽極氧化峰計算值高的多(前者是后者的2.6倍), 而按照陽極氧化峰積分面積,由公式Γ = Q/FnVAS(式中F為法拉第常數, V為掃描速率, AS為電極的活性表面積, n為電極反應得失電子數, 此值為1)計算所得的導電酶分子濃度接近前述數值(大約是1.0 × 10–8molcm–2), 此外圖4所示的固酶電極在電位低于0.30 V時還原電流會隨著電位負移明顯增大, 這表明會有其他物種在固酶電極上發生還原反應, 可以合理地推測可能是固酶載體中吸附的氧分子在Lac作用下電化學還原導致. 從圖4還可看出, 固酶電極在氧氣飽和的PBS溶液中掃描所得的CV與無氧溶液相比有較大區別: 當電位低于0.80 V時隨著電位的負移, 陽極氧化電流急劇下降,而陰極還原電流則有較大程度地增加, 這表明固酶電極對氧還原有明顯的電催化效應. 固酶電極上氧還原起始電位約為0.82 V, 當電位達到0.45 V左右時電流隨電位負移變化程度較小即達到極限電流, 但當電位低于0.30 V后還原電流又繼續相對緩慢增加. 相對于未固定Lac的納米復合物電極CMCHNDMPC/GC電極(氧還原起始電位大約是0.30 V, 參見圖S2 (Supporting Information)), 固酶電極氧還原的超電勢降低了520 mV. 值得注意的是未固定酶的電極催化氧還原起始電位也是在0.30 V左右, 與前述結論相一致, 可以合理推測CMCH-NDMPC納米復合物可以選擇性吸附氧氣分子, 當電位足夠負時,就可以使得吸附在納米復合物介孔中的氧分子發生電還原. 本文獲得的這種納米復合物固定Lac電極具有較低的氧還原超電勢(大約是150 mV)和較高的極限催化電流密度j (定義為在極限擴散電流密度對應電位處還原電流密度之差: 54.4 μAcm–2), 與早先文獻報道的固酶電極的性能(使用電子中介體的固酶電極催化氧還原起始電位大約是780 mV, 而固酶電極直接電催化氧還原起始電位大約是750 mV),6,10鉑系貴金屬催化劑(在相同條件下催化氧還原的起始電位660 mV)27以及其他實現直接電子遷移的固酶電極28,29相比仍然具有一定優勢, 但與最近報道的光調控酶燃料電池Lac基陰極的性能相比則還有相當的差距.30按照文獻31給出的公式j = nFksΓ,已知極限催化電流密度j, 導電酶分子表面濃度Γ以及得失電子數n (由于Lac催化氧還原分子按照四電子機制進行,16,26故n應為4)的前提下便可以求出催化反應的表觀速率常數ks為1.3 × 10–2s–1. 這一表觀速率常數與文獻報道的幾種實現直接電子遷移的Lac基電極相比, 具有相近的酶-電極間電子遷移動力學(它們的催化反應表觀速率常數分別為0.01 s–122和0.03 s–110), 但不如貴金屬催化劑鉑在酸性溶液中催化氧還原的平均轉化率(每秒0.52 氧分子).27

圖5A為3個在不同時間按照同樣工序制備的納米復合物固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和的PBS中掃描所得CV曲線上極限催化電流的對比圖. 從圖5A可以看出: 三個不同Lac/CMCHNDMPC/GC電極的極限催化電流沒有明顯差異, 說明本文制備的電極具有良好的重現性; 圖5B為Lac/CMCH-NDMPC/GC于氧氣飽和的PBS中掃描所得極限催化電流與電極低溫儲存時間的關系曲線. 從圖5B可以看出: 新制備的Lac/CMCHNDMPC/GC在氧氣飽和的PBS中立即進行測試所得極限催化電流和此電極在4 °C冰箱中儲存7 d后測試得到的極限催化電流差異很小而且氧還原起始電位沒有明顯改變(通過對比兩者的CV可以看出, 圖不再給出), 而氧還原電流密度的降低幅度低于5%: 隨著儲存時間延長固酶電極催化氧還原性能緩慢下降, 當低溫儲存時間超過10 d后電極催化氧還原性能下降迅速, 但即使電極儲存21 d后電極催化性能仍然可以保留初始值的大約70%, 這一結果要優于文獻32報道的鋨為中心離子的氧化還原水凝膠固定Lac基電極的長期使用性能(同樣溫度下儲存21 d后性能下降到不足初始值的15%). 以上實驗結果表明本文制備納米復合物固定Lac電極不但具有很好的重現性, 而且其催化活性能夠保持長期穩定性. 在此基礎上, 我們還進一步以CV結合旋轉圓盤電極技術考察了Lac/CMCH-NDMPC/GC電極在液流剪切力作用下的力學穩定性. 圖5C為Lac/CMCHNDMPC/GC電極在氧氣飽和PBS中以不同電極旋轉速率在恒定電位掃描速率(10 mVs–1)條件下獲得的CV曲線. 從圖5C可以看出: 與作為對比的Lac/CTSNDMPC/GC(參見圖S3 (Supporting Information), 此電極在剪切力作用下表面固酶薄膜會破損導致表面固定Lac泄漏, 從而引起催化氧還原電流明顯下降)不同, 隨著電極旋轉速率從100 rmin–1提高到2500 rmin–1, 沒有觀察到類似于對比電極上氧還原電流隨著電極轉速提高而衰減的現象. 這一現象說明, 本文制備的納米復合物固酶電極能承受較高的剪切力. Lac/CMCH-NDMPC/GC具有良好的力學穩定性的原因可以歸因于: CMCH具有更高的黏度、成膜性和在水中更良好的分散性, 因此形成的納米復合物薄膜具有更高的剪切力耐受性; 此外CMCH側鏈上的羧基可以和Lac分子表面的氨基酸殘基的氨基發生相互作用而偶聯, 在這些因素的協同作用下, CMCH-NDMPC納米復合物固定Lac的力學穩定性明顯高于CTS-NDMPC復合物固定的Lac.此外無論電極旋轉速度快慢甚至于是否旋轉, 所獲得的CV曲線沒有顯著差異, 這一現象與多數已知文獻報道的固酶電極在類似體系中測定結果有明顯不同(后者極限催化電流隨著電極旋轉速率提高有明顯的增加),31,33這表明溶液中氧氣的傳質速率不是該反應的決速步驟, 納米復合物中組分NDMPC的介孔結構和獨特的表面化學環境(含氮雜環等)有助于快速吸附氧分子.21這一結論與圖4的分析結果相一致. 通過對比固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和的不同pH值PBS緩沖液中相同掃描速率下獲得的CV曲線發現(圖不再給出), 隨著溶液pH的升高電極催化氧還原的起始電位沒有發生變化, 但極限催化電流明顯下降, 這與文獻報道的結果相一致,6,34即與游離Lac表現的催化活力–pH依賴關系相似, 隨溶液pH升高, 酶活性中心T3優先結合溶液中的OH–而非氧分子, 因此降低了氧還原催化電流. 進一步實驗結果(參見圖S4 (Supporting Information))也表明納米復合物固定Lac催化氧還原性能與游離Lac類似, 存在一個最佳pH, 但與游離Lac不同,34最佳pH值出現在4.4, 因此pH = 4.4被設定為測試固酶電極催化氧還原性能的工作pH. 此外從Lac/CMCHNDMPC/GC的極限催化電流–溫度關系圖(參見圖S4)還可以看出: 在測試的溫度區間內, 隨著溶液溫度的增高, 電極極限催化電流在65 °C之前隨之緩慢升高, 在此之后隨著溫度繼續升高, 催化電流迅速下降, 這一結果與游離Lac34以及文獻33報道的氧化還原水凝膠固酶電極催化活力/催化電流–溫度關系結論相一致, 根據文獻提供的方法可以粗略估算電極表面固定Lac催化氧還原反應的表觀活化能是12.8 kJmol–1, 酶變性的活化能是78.1 kJmol–1.33從上述實驗現象和計算的活化能可以推斷Lac在納米復合物載體上的固定方式接近于化學吸附或化學鍵合,這也解釋了固酶電極力學性能優越和重現性, 長期使用性能良好的原因.

圖5 在0.2 moldm–3氧氣飽和的PBS(pH = 4.4)中Lac/CMCH-NDMPC/GC催化氧還原性能的重現性(A), 長期穩定性(B)以及力學穩定性(C)Fig.5 Reproducibility (A), long-term stability (B), and mechnical stability (C) in catalytic effect on oxygen reduction reaction (ORR) of Lac/CMCH-NDMPC/GC in 0.2 moldm–3oxygen-bubbled PBS (pH = 4.4)

圖6為不同酶固載量的Lac/CMCH-NDMPC/ GC在氧氣飽和PBS緩沖液中以相同掃描速率獲得的LSV曲線, 從圖6可以看出: 隨著電極表面固定Lac量從0.42 mg上升到1.50 mg時, 催化氧還原起始電位沒有明顯的變化, 但催化氧還原電流隨之線性增大(參見圖6插圖). 但當載體對Lac的擔載量即電極表面固酶量達到一定數值(約1.50 mg)之后, 即便繼續增加電極表面固酶質量, 相應的電極的極限催化氧還原電流也不再增加(即使電極表面酶擔載量遠超過1.50 mg時亦是如此, 參見圖6插圖), 這一結果與文獻35建立模型預測的結果相一致, 這就是所謂的“電極表面吸附的導電酶分子極限濃度”. 而根據前述計算得到的電極表面實現電子導通的酶分子表面濃度(1.1 × 10–8molcm–2)和Lac的分子量(68000)可以粗略估算出實現直接電子導通的酶占固載總量的1/4, 這一數值高于1-芘基丁酸琥珀酰亞胺酯功能化多壁碳納米管/碳紙固酶電極表面實現直接電子導通酶占固載酶總量的百分數(大約15%),10更遠超過文獻22報道的納米多孔金固酶電極上實現直接電子導通的酶占固酶總數的百分比(只有大約1/400). 從Lac/CMCH-NDMPC/GC靜態時在氧氣飽和的PBS中以10 mVs–1掃描獲得的Tafel曲線(參見圖S5 (Supporting Information))中可以看出:同文獻9報道的固酶稠環芳烴修飾熱解石墨電解電極在飽和氧氣的檸檬酸鈉緩沖液(pH = 4.0)中的Tafel曲線類似, 本文制備的固酶電極在氧氣飽和的PBS中的Tafel曲線也沒有線性區域, 而且塔菲爾斜率為118 mV(對應于單電子反應)時對應的電位(～755 mV)非常接近于CV曲線中還原電流開始急劇增高的電位(770 mV), 同時此電位也很接近漆酶活性位T1位的式電位, 這與文獻9報道的結論相一致, 即表明固定Lac電極催化氧還原首先是在T1位得到電子,隨后再通過分子內電子傳遞鏈到達由三個銅離子構成的T2/T3三核銅簇, 并在T2式電位(大約是400 mV)附近達到極限電流或峰電流(T2銅形成的橋聯過氧化物分解對應電位). 這種納米復合物固定Lac之所以能夠實現與電極之間的直接電子導通,與NDMPC的化學結構有關聯, 這種介孔碳材料含有sp2的碳原子和吡啶結構的氮原子, 因此可以憑借共軛體系之間存在的疏水–疏水作用使介孔碳材料接近Lac分子T1活性位附近的疏水結合位, 同時雜原子與Lac分子中的Cu離子之間的相互作用(例如雜原子充當軸向配體)16可能有利于酶分子以合適的構象定位在介孔碳材料表面, 利于電子在酶-導電基體NDMPC之間的直接遷移.

3.3 組裝葡萄糖/氧氣生物燃料電池的性能

與前述Lac/CMCH-NDMPC/GC不同, 固酶陽極GOx/CMCH-NDMPC在沒有電子中介體和底物葡萄糖存在時, 觀察不到任何表征GOx活性中心發生電子得失或酶催化底物氧化的電信號(即產生的CV沒有明顯區別, 圖不再給出), 也不能有效催化葡萄糖的氧化(即電極在含葡萄糖與不含葡萄糖的無氧溶液中掃描所得LSV沒有明顯區別, 圖不再給出), 因此必須加入常用的電子中介體FMCA來促進酶活性中心和導電基體之間的有效電子遷移, 以達到有效催化底物葡萄糖的目的. 圖7為固酶陽極在含不同濃度葡萄糖的0.2 moldm–3無氧PBS(0.5mmoldm–3FMCA)中的LSVs. 從圖7可以看到, 在不含底物葡萄糖時, 只有FMCA的氧化峰出現(氧化峰電位在560 mV附近, 與文獻36報道值(540 mV)相近),當加入不同濃度的葡萄糖時, 固酶電極催化葡萄糖氧化的起始電位均始于370 mV附近, 且隨著加入葡萄糖濃度的增加, 氧化峰電流隨之線性增大(參見圖S6 (Supporting Information)), 但當葡萄糖濃度超過40 mmoldm–3之后, 極限催化電流增長速度下降, 繼續緩慢增長直至達到穩態催化電流為止. 值得注意的是, 當陰陽極底物濃度相近, 掃描速率相同, 且pH值均為6時(陰極氧氣和陽極葡萄糖濃度的濃度都是1.1 mmoldm–3), 陰極極限催化電流(參見圖S4)是陽極極限催化電流的大約6倍之多, 這與文獻37,38報道的情況有明顯不同, 這表明陰極氧氣擴散傳質過程不是影響整個電池性能的關鍵, 氧氣分子在載體的快速吸附很可能阻止了陽極上的GOx與葡萄糖之間的化學反應(另外氧氣分子和GOx分子之間的快速化學反應速率(600 s–1)39也比葡萄糖氧化反應的速率和FMCA在電極表面電化學氧化還原速率快得多).

圖6 不同酶固載量的Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和0.2 moldm–3PBS(pH = 4.4)中的LSVsFig.6 LSVs of Lac/CMCH-NDMPC/GC in 0.2 moldm–3oxygen-saturated PBS (pH = 4.4) with different enzymeloading amounts

圖7 GOx/CMCH-NDMPC/GC在含不同濃度葡萄糖的0.2 moldm–3無氧PBS (pH = 6.0, 0.5 mmoldm–3FMCA)中的LSVsFig.7 LSVs of GOx/CMCH-NDMPC/GC in 0.2 moldm–3deaerated PBS (pH = 6.0) with 0.5 mmoldm–3FMCA at different concentration level of glucose

圖8為CMCH-NDMPC納米復合物固酶葡萄糖/ O2燃料電池于特定測試體系(如前所述, 實現直接電子導通的Lac與導電基體之間電子遷移的速率0.01 s–1比較低, 為了改善陰極電子遷移性能引入了最常用且性能相對最好的ABTS6)中得到的極化和性能曲線. 從圖8中可以看出: 固酶燃料電池的開路電壓(OCV)大約是0.38 V , 在0.16 V處呈現的最大輸出能量密度大約是19.2 μWcm–2. 由于酶-電極間遷移速率不夠快以及存在隔膜電阻等因素的綜合影響,本文制備的酶基燃料電池的OCV不但和理論上此電池最大輸出電壓0.87 V相比較存在490 mV的電壓差, 就是與文獻報道的羥基磷灰石-多壁碳管固酶基燃料電池的OCV (0.58 V),23多壁碳納米管固定Lac基燃料電池的OCV (0.62 V)28以及碳納米管基葡萄糖/AA-O2酶燃料電池的性能(OCV 0.62–0.84 V)40相比也有不小的差距, 大體與文獻報道的固定Lac納米石墨烯薄片修飾電極基燃料電池的OCV (0.44 V)38相當. 這可以歸因于載體固定的酶分子并沒有完全實現活性中心與導電介質的定向連接, 活性中心與導電介質的間距排布仍然具有隨機性. 但是本文制備的燃料電池的輸出能量密度相比于上述文獻報道的燃料電池仍然具有一定的優勢: 這些電池在相應電壓處最大輸出能量密度分別是: 15.8 μWcm–2(0.28 V),2310.0 μWcm–2,28大致和文獻報道的酶, 中介體和多壁納米管復合物基葡萄糖/O2燃料電池41的最大輸出能量密度(～20 μWcm–2)相當, 但是只有固定Lac納米石墨烯薄片修飾電極基燃料電池38最大輸出能量密度(57.8 μWcm–2)的1/3左右.41從固酶葡萄糖/O2燃料電池最大輸出能量密度與工作時間的關系曲線(參見圖S7 (Supporting Information),可以看出7 d之內隨著電池使用時間的延長, 電池最大輸出功率隨之緩慢降低, 電池使用7 d之后最大功率密度仍然可以保持最初值的90%以上; 當電池工作時間超過7 d之后, 工作效率下降速度明顯加快,但即便電池使用時間3 week之后電池的輸出功率密度仍可達到初始值的60%以上, 這一結果優于文獻報道的氧化還原水凝膠固定Lac基電池的長期使用性能(使用3 week后功率密度不到初始值的20%和40%).32,33綜上所述, 本文制備的CMCH-NDMPC不但對所固載的酶(無論是GOx還是Lac)具有良好的生物親和力, 使其具有較高的催化活力而且具有良好的長期使用性能, 但此固酶燃料電池的能量輸出性能還有進一步改善的余地.

3.4 Lac/CMCH-NDMPC/GC作為氧電化學傳感器的性能

圖9為Lac/CMCH-NDMPC/GC和另一種作為對比電極的Lac/NGPs-modified/GC(電極制備參見參考文獻38)分別在不含電子中介體ABTS的無氧PBS溶液中, 緩慢加入不同體積空氣飽和PBS溶液時產生的響應電流與時間關系曲線, 插圖則是Lac/ CMCH-NDMPC/GC對氧氣的響應極限催化電流與底物氧分子濃度之間的關系曲線. 從圖9及插圖可以看出: Lac/CMCH-NDMPC/GC在無中介體存在時對氧分子有強烈而迅速的響應, 即高靈敏度(為12.1μAμmol–1dm3), 這一數值遠高于文獻報道6的殼聚糖-多壁碳納米管固定Lac電極在擴散型電子中介體ABTS存在時對氧分子的靈敏度(27.3 μAmmol–1dm3). 此種固酶電極對氧的檢測限可以低至0.04 μmoldm–3, 這一數值與文獻6報道的固酶電極(7.8 μmoldm–3)相比低得多, 結合根據雙倒數L-B曲線擬合所得的固酶電極對氧分子的KM數值(8.2 μmoldm–3)來看, 本文制備的固定Lac的CMCHNDMPC納米復合物對氧氣的親和力很高, 不但高于文獻6報道的固酶電極對氧的親和力(KM= 3.22 mmoldm–3), 而且遠遠高于其對葡萄糖的親和力(參見Supporting Information (KM= 128.4 mmoldm–3)),這和前述結論相一致. 根據圖9還可以粗略計算出固酶電極化學結合氧分子的速率(以氧分子消耗的速率表示), 再根據電極表面層固定并實現與導電基體直接電子導通Lac的表面濃度就可以得到歸一化的酶催化氧還原表觀速率常數為0.023 s–1, 結合前述酶-電極間直接電子遷移的速率(0.013 s–1)及分子內電子遷移速率(1000 s–1)27,33來看, 整個固酶電極催化過程受限于酶-電極之間電子遷移的速率, 即如何使固定酶分子采取更有利于實現酶活性中心-導電基體電子遷移的定向鏈接的構型將是改善這類固酶電極的關鍵.

圖8 CMCH-NDMPC固酶基葡萄糖/O2生物燃料電池的極化曲線(■)和性能曲線(Δ)Fig.8 Polarization curves (■) and performance curves (Δ) of as-assembled CMCH-NDMPC with entrapped enzyme based glucose/O2biofuel cell

圖9 計時電流法表征Lac/CMCH-NDMPC/GC作為電化學傳感器對氧傳感的性能Fig.9 Performance for oxygen detection of Lac/CMCHNDMPC/GC as electrochemical sensor characterized by chronoamperometric measurements

4 結 論

利用成膜劑CMCH和導電基體NDMPC機械共混所得的納米介孔復合物作為固酶載體, 制備了兩種固酶電極: Lac/CMCH-NDMPC/GC和GOx/CMCHNDMPC/GC. 系統研究這類固酶電極的直接電化學行為及其對各自底物的催化性能, 測試了這類電極催化性能重現性, 長期使用性能, 力學穩定性以及pH耐受性, 評估了固定Lac電極對氧分子的電化學傳感性能; 在此基礎上將兩種固酶電極組裝成為酶燃料電池, 在離子交換膜存在前提下測試了這一電池的能量輸出性能和長期使用性. 實驗結果表明:這種固酶電極可以在無電子中介情況下實現Lac活性中心T1與電極之間的有效電子通訊但不能實現GOx活性中心與電極間的直接電子導通, 而且固定Lac陰極對氧還原具有良好的催化性能: 氧還原起始電位可達820 mV, 實現電子導通的Lac分子占電極表面固定酶分子數的近1/4, 單位時間內轉化底物分子速率可達2.3 × 10–2s–1. 這種固酶電極具有對氧的檢測限低(0.04 μmoldm–3), 對氧的親和力高(KM= 8.2 μmoldm–3), 而且具有更高的對底物靈敏度(12.1μAμmol–1dm3)之優勢. 通過分析固酶電極催化氧還原動力學, 可以判定固酶陰極上催化反應過程受制于酶活性中心T1與導電基體間直接電子遷移的速率. 這種固酶燃料電池能量輸出性能測試結果表明其開路電壓OCV為0.38 V, 最大輸出能量密度為19.2 μWcm–2, 此電池在使用3 week之后電池的輸出功率密度仍可達到初始值的60%以上. 如果通過調控載體表面化學結構, 載體孔徑和介孔內部環境以實現酶-電極間電子遷移性能優化, 從而實現燃料及氧化劑同時被酶充分催化反應, 此種電池的能量輸出性能將會有較大程度的提高.

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Performance of Nitrogen-Doped Carbon Nanocomposite with Entrapped Enzyme-Based Fuel Cell

HAYIERBIEK Kulisong ZHAO Shu-Xian YANG Yang ZENG Han*
(Chemistry and Chemical Engineering Academy, Xinjiang Normal University, Urumuqi 830054, P. R. China)

A nanocomposite composed of N-doped mesoporous carbon material (NDMPC) and carboxymethylated chitosan (CMCH) was fabricated by mechanical co-mixing and used as an enzyme matrix. A novel glucose/O2enzymatic biofuel cell was fabricated with a Nafion ion-exchange membrane consisting of a laccase (Lac)-entrapped biocathode and glucose oxidase-incorporated bioanode. Enzyme electrodes were prepared by the dripping coat and air-dried method. The performance of the laccase-based electrode as a biocathode in a fuel cell and an oxygen electro-chemical sensor was characterized by cyclic voltammetry in combination with the rotating disk electrode technique, linear scanning voltammetry (LSV), and chronoamperometry. UV-Vis spectrometry and graphite furnace atomic absorption spectroscopy were used to investigate the configuration of enzyme molecules on the surface of electrode and to evaluate the enzymeloading of the matrix on the electrode interface. The results from the experiments showed that the laccasebased cathode displayed direct electron transfer between the active centre in laccase (T1) and the conductive matrix without any external electron mediators (apparent electron transfer rate 0.013 s–1). A minor overpotential for oxygen reduction (150 mV) was also observed. Through further comparison of the intra-molecule electron relay rate (1000 s–1), substrate turnover frequency (0.023 s–1), and previous enzyme-conductive matrix electron transfer rate, quantitative analysis showed that the latter was the rate-determining step in the whole catalytic cycle of the oxygen reduction reaction. This laccase-based electrode as an oxygen electrochemical sensor for detecting oxygen showed a low detection limit (0.04 μmoldm–3), high sensitivity (12.1 μAμmol–1dm3), and affinity for oxygen (KM= 8.2 μmoldm–3). This laccase-based cathode also had advantages such as excellent reproducibility, long-term usability, thermal stability, and pH endurance. The results for the fabricated biofuel cell showed an open circuit voltage of 0.38 V and a maximal energy output density of 19.2 μWcm–2, maintaining greater than 60% of the initial value even after continuous work for 3 weeks under optimal conditions.

Laccase; Nitrogen-doped meso-porous carbon material; Carboxymethylated Chitosan; Direct electron transfer; Oxygen reduction reaction; Electrochemical sensor; Bio-fuel cell

O643.3

10.3866/PKU.WHXB201506231

Received: March 31, 2015; Revised: June 23, 2015; Published on Web: June 23, 2015.

*Corresponding author. Email: zenghan1289@163.com; Tel: +86-991-4332279.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (21363024), Ph. D. Scientific Initiate Funding Project of Xinjiang Normal University, China (XJNUBS1228), and Xinjiang Autonomous Region 2013 Annual Colleges and Universities Scientific Research Plan-Young Teacher Cultivation Project, China (XJEDU2013S29).

國家自然科學基金(21363024), 新疆師范大學博士科研啟動基金(XJNUBS1228)及新疆維吾爾自治區2013年度高校科研計劃青年教師培育項目(XJEDU2013S29)資助

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