替米沙坦減輕DOCA－鹽型高血壓大鼠氧化應激改善血管內皮功能研究

張黎黎，劉愛東，蒲春華，王 芳，周 鵬，李文章，楊 震△

1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 神經內科（成都 610500）；2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 心血管內科（成都 610500）

高血壓是腦卒中的重要危險因素，《中國心血管病報告（2013）》指出，目前我國已有超過2.7億的高血壓患者，腦卒中現患人數約為700萬，高血壓相關的心腦血管疾病的防治形勢相當嚴峻。鹽與高血壓的關系基本明確，約有50%的高血壓為鹽敏感性高血壓，提示鹽敏感性高血壓是高血壓中的一個重要類型［1］。在遺傳與環(huán)境因素的交互作用下，高血壓對心、腦、腎等靶器官的損害涉及多種機制，氧化應激是關鍵的共同環(huán)節(jié)［2］。在高鹽環(huán)境下，機體氧化應激水平顯著升高，長期的高鹽暴露，即使血壓未明顯升高亦可出現顯著的血管內皮損害，血管內皮的損傷則是一切心腦血管疾病的基礎［3］。因此，理想的降壓藥物不應只針對血壓，還應針對氧化應激及其所介導的血管內皮損害。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，近年研究［4－5］發(fā)現其不僅具有顯著的降壓作用，還可通過激活過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ），顯著改善血管內皮功能，但其對高鹽介導的血壓和氧化應激水平的升高及血管內皮功能障礙的影響未見有直接的報道。本研究通過復制DOCA－鹽型高血壓大鼠模型，觀察替米沙坦對該模型大鼠血壓、氧化應激及血管內皮功能的影響，以期為替米沙坦防治鹽敏感性高血壓及相關的血管內皮功能障礙提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及干預方式

健康雄性SD大鼠24只（四川省成都達碩實驗動物有限公司提供），體質量（200±8）g，分籠飼養(yǎng)，自由進水、進食，喂食1次/d，隔日換水。動物房為自然晝夜采光，室溫22～26℃，濕度維持在50%左右。在造模前先進行適應性飼養(yǎng)1周。

大鼠分假手術組、DOCA－模型組、DOCA－替米沙坦組、DOCA－氨氯地平組，每組各6只。DOCA－替米沙坦組在術后經胃管灌服替米沙坦（10mg/kg）生理鹽水混懸液，1次/d；DOCA－氨氯地平組術后經胃管灌服氨氯地平（5mg/kg）生理鹽水混懸液，1次/d；假手術組與DOCA－模型組均給予灌服等體積的生理鹽水，總干預時間為1月。

1.2 動物模型的建立［6］

［6］方法：大鼠以戊巴比妥鈉麻醉后，取俯臥位，統(tǒng)一取脊柱右側腎區(qū)進行備皮，常規(guī)消毒后作一長約1～1.5cm的切口，暴露腎臟，緊貼腎門處以手術線結扎后切除腎臟，清洗后逐層縫合，以青霉素肌注預防感染。術后，除假手術組外，其余各組大鼠每周給予皮下注射醋酸去氧皮質酮（DOCA）［120mg/kg，溶于注射用油/乙醇（5/1，v/v）中］，并給予高鹽（1%NaCl，0.2%KCl）飲水，共1月；假手術組則皮下注射等體積的溶劑，每周1次。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 鼠尾無創(chuàng)動脈血壓測定［5］采用北京軟隆公司生產的鼠尾血壓計測定，參考既往方法，每只動物測3次，取平均值，造模前測定基礎血壓水平，以后每周測量1次。

1.3.2 血管功能的測定 參照文獻［5］方法：采用丹麥DMT公司生產的微血管張力測定儀（DMT 620M）測定。實驗結束后大鼠以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后先取血液標本，后迅速打開腹腔，取腸袢，固定并浸泡于 Kreb＇s液中，并通以 CO2/O2（5%/95%）混合氣體，于解剖顯微鏡下迅速分離2～3級腸系膜動脈，截取長約2～3mM的血管條，以40 μM鋼絲穿過后懸掛于浴槽中，繼續(xù)通以CO2/O2混合氣體，穩(wěn)定約30min后調初張力（2mN），穩(wěn)定約30min后以KCl預激3次，以苯腎上腺素（10－5mol/L）刺激，分別進行乙酰膽堿（10－9～10－5mol/L）誘導的血管內皮依賴性舒張功能和硝酸甘油誘導的非內皮依賴性舒張功能測定（10－9～10－5mol/L）。利用prism 3.0軟件描繪擬合曲線，計算最大舒張反應（Emax，%）。

1.3.3 血漿SOD、MDA的測定 取非抗凝血，于3 000r/min低速離心機離心10min后取血清。采用硫代巴比妥酸（TBA）縮合法測定血清中MDA含量；采用黃嘌呤氧化法測定血清中SOD活性，具體操作按試劑盒（購于南京建成生物工程研究所）說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數據錄入及統(tǒng)計分析，以prism 3.0制圖。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠鼠尾收縮壓的影響

造模前各組大鼠的鼠尾收縮壓（SBP）分別為：假手術組（128±11）mm Hg，DOCA－模型組（131±10）mm Hg，DOCA－替米沙坦組（133±12）mm Hg，DOCA－氨氯地平組（129±11）mm Hg，各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。造模后第1周開始，DOCA－模型組血壓顯著高于假手術組，經替米沙坦10mg/（kg·d）或氨氯地平5mg/（kg·d）干預4周后，各組大鼠鼠尾收縮壓分別為：DOCA－替米沙坦組（162±13）mm Hg，DOCA－氨氯地平組（157±12）mm Hg，均顯著低于DOCA－模型組（190±13）mm Hg，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DOCA－替米沙坦組與DOCA－氨氯地平組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠鼠尾血壓的影響

2.2 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠氧化應激水平的影響

與假手術組比較，DOCA－模型組大鼠血清SOD水平顯著下降，血清MDA水平顯著上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；替米沙坦干預可顯著升高大鼠SOD水平（156.49±11.02）U/mL，降低 MDA水平（8.34±0.92）nmol/L，與 DOCA－模型組大鼠比較，SOD（120.46±9.24）U/mL，MDA（612.25±1.35）nmol/L，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；氨氯地平干預對血清SOD和MDA水平影響比較，差異均無統(tǒng)計學意義，與DOCA－模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

2.3 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠血管功能的影響

DOCA－鹽型大鼠乙酰膽堿誘導的血管內皮依賴性舒張功能顯著下降［Emax（%），假手術組（86.63±6.07），DOCA－模型組（63.75±6.51）］；替米沙坦干預可顯著改善血管內皮依賴性舒張功能［Emax（%），（76.70±4.41）］，與 DOCA－模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；DOCA－替米沙坦組與DOCA－模型組內皮依賴性舒張功能的差異在預孵一氧化氮合酶的抑制劑L－NAME作用后消失；DOCA－氨 氯 地 平 組 ［Emax（%），（68.19±4.96）］有改善血管內皮依賴性舒張功能的趨勢，但經統(tǒng)計學比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。替米沙坦及氨氯地平對硝酸甘油誘導的血管非內皮依賴性舒張功能影響比較，差異均無統(tǒng)計學意義，與DOCA－模型組及假手術組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3、圖4）。

圖2 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠血清SOD和MDA水平的影響

圖3 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠乙酰膽堿誘導的血管內皮依賴性舒張功能的影響

圖4 替米沙坦對DOCA－鹽型大鼠硝酸甘油誘導的血管內皮依賴性舒張功能的影響

3 討論

流行病學和基礎實驗研究均已證實了鹽與高血壓及相關靶器官損害的關系。DASH（Dietary Approaches to Stop Hypertension）飲食研究［7］表明，每日食鹽攝入量在6g以下可減少收縮壓2～8 mm Hg，有效降低了卒中的發(fā)生率。我國流行病學研究也表明，喜高鹽飲食的東北地區(qū)高血壓與腦卒中的發(fā)生率顯著高于清淡飲食的華南地區(qū)。但另一方面，個體對鹽的敏感性存在顯著差異，高鹽導致血壓升高及靶器官損害涉及多種機制［1］。目前普遍認為，氧化應激與眾多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯系［8］。同樣在鹽敏感性高血壓中，鹽的敏感性與機體氧化應激反應性增強，體內氧化－抗氧化系統(tǒng)失衡導致活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）的產生增加有密切的聯系［9］。ROS可快速滅活具有保護血管作用的NO，而且ROS與NO結合后可生成具有更強氧化活性的硝基化產物，這些均是導致血管內皮結構與功能損害的重要物質［10］。眾所周知，內皮的損害是一切心血管疾病發(fā)生的起始環(huán)節(jié)，它將導致血壓升高和靶器官損害。

DOCA－鹽型高血壓大鼠是鹽皮質高血壓合并腎功能損害的模型，具有水鈉潴留、氧化應激、炎癥水平顯著升高和靶器官纖維化等特征。與既往的研究［11］一致，本實驗復制的DOCA－鹽型高血壓大鼠模型具有顯著的血壓升高、氧化應激及血管功能障礙的特征，提示造模成功。

盡管鹽敏感性高血壓及相關靶器官損害的研究已進入基因、分子水平，但目前對于鹽敏感性高血壓的確切機制研究、臨床患者鹽敏感性的判斷及針對鹽敏感性高血壓的干預措施仍不盡人意。近年關于干預心血管剩留風險的觀念提醒我們，降壓治療固然功不可沒，但仍要關注降壓以外的其他心血管保護途徑。多項臨床研究及大型薈萃分析表明，ARB類藥物（替米沙坦）與CCB類藥物（氨氯地平）比較，其降壓作用相對較弱，但卻具有較好改善心臟重構、代謝等降壓以外作用的效果。替米沙坦是ARB類藥物的一個典型，該藥具有降壓以外的改善代謝的作用。基礎研究［12－14］證實，替米沙坦不但作用于RAAS系統(tǒng)，阻斷AT1受體，還可直接激活PPARγ或PPARβ，具有改善糖、脂代謝和血管內皮功能的作用。既往研究［5］表明，替米沙坦通過激活PPARγ可顯著改善老齡鼠腦血管內皮依賴性舒張功能；另一項研究［15］表明，PPARγ激動劑通過減輕氧化應激水平，可顯著改善老齡鼠腦血管內皮依賴性舒張功能。MDA是自由基引起的脂質過氧化過程中生成的一種醛類物質，能夠促進核酸、蛋白質和磷脂的交聯，從而破壞生物大分子的功能。SOD可清除過氧化氫和超氧陰離子，從而保護細胞不受毒性氧自由基的損傷，故本研究采用分析大鼠血清中的SOD和MDA水平來評估大鼠體內的氧化應激水平。本研究發(fā)現，替米沙坦可顯著降低DOCA－鹽型大鼠血清中MDA的水平，升高SOD的水平，上述作用均顯著優(yōu)于氨氯地平，為此，筆者推測，替米沙坦對DOCA－鹽型高血壓大鼠血管內皮功能的改善作用可能與改善其氧化應激水平有關。

但替米沙坦通過何種途徑達到改善DOCA－鹽型大鼠氧化應激的作用機制尚不明確。有研究［16］分別利用平滑肌PPARγ敲除和血管內皮PPARγ敲除的小鼠觀察PPARγ激動劑對DOCA－鹽型模型血壓和血管功能的影響，結果表明，敲除血管內皮的PPARγ顯著減弱了PPARγ激動劑的降壓作用。另有研究［17］證實，替米沙坦以PPARγ依賴的方式，顯著降低DOCA－鹽型大鼠NADPH氧化酶的活性。課題組前期研究［15］證實，激活老齡鼠血管內皮上的PPARγ，通過UCP2依賴的方式，可顯著減少血管內皮細胞ROS的水平，增加NO水平，從而改善老齡相關的血管內皮功能障礙。上述研究提示，替米沙坦可能通過激活PPARγ，調控體內氧化應激水平，減少ROS的生成，從而改善血管內皮功能，但確切的機制有待進一步深入研究。

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