內質網應激在高糖所致血管平滑肌細胞鈣化中的作用與機制

劉 暢，吳 斌，李興岳，吳子君，姜佳美，游 瓊，吳 鏗，郭潤民

廣東醫學院附屬醫院 心血管內科（湛江 524001）

糖尿病是全球常見的內分泌代謝障礙疾病，嚴重危害人類健康；心腦血管疾病是糖尿病患者最常見死因［1］，糖尿病血管鈣化是心腦血管疾病高發病率和病死率的獨立危險因素［2］，也是糖尿病常見的獨立并發癥之一。一直以來血管鈣化（鈣磷沉積）被認為是被動的退行性病理變化，經過多年來研究發現，血管鈣化是伴有胚胎期骨骼發育特點的嚴密調控的主動過程，即血管壁細胞（主要是血管平滑肌細胞vascular smooth muscle cells，VSMCs）分化為成骨樣細胞［2］。

近期研究［3－4］發現，糖尿病（體外高糖）狀態下能引起血管鈣化（VSMCs鈣化），同時導致內質網（endoplasmic reticulum，ER）應激，并且高糖引起VSMCs鈣化可能是類似于骨發育、血管壁細胞和細胞外基質共同作用的主動性病理過程［5－6］。但是，ER應激以及凋亡在高糖誘發VSMCs鈣化中的作用機制尚不清楚。為此，本研究擬采用高糖處理大鼠VSMCs模擬機體糖尿病環境，探索ER應激在高糖所致VSMCs鈣化中的作用與機制。

1 材料和方法

1.1 材料

D－葡萄糖、4－苯基丁酸（4－phenylbutyric acid，4－PBA）、Hoechst 33258購自美國 Sigma－Aldrich公司。堿性磷酸酶測定試劑盒購自南京建成科技公司，DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。抗GRP78、抗CHOP、抗Caspase－12、抗Runx2和抗GAPDH等抗體購自美國Cell Signaling Technology Inc。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與實驗分組 大鼠VSMCs由中山大學實驗動物中心提供，10%胎牛血清的DMEM培養基置于5%CO2、37℃的溫箱中培養。實驗分為6組：對照組、高糖組、β－甘油磷酸組、β－甘油磷酸＋高糖組、4－PBA 預處理＋高糖組（用500μmol/L 4－PBA作用VSMCs30min，撤去，用PBS洗兩次，接著35mmol/L D－葡萄糖作用24h）和4－PBA 組（500μmol/L 4－PBA作用 VSMCs 30min）。

1.2.2 鈣含量測定 上述各組VSMCs經不同處理后，PBS沖洗3次，每孔加入0.6mol/L 鹽酸37℃脫鈣1h，采用甲基百里香酚藍比色法鈣離子定量檢測試劑盒測定上清液中鈣含量，剩余細胞用PBS沖洗3次，加入細胞裂解液溶解30min后，使細胞充分裂解提取胞質蛋白，以上清液鈣含量除以細胞蛋白含量即為鈣含量。

1.2.3 堿性磷酸酶活性測定 將上述各組VSMCs經不同處理后接種于12孔培養板中，棄培養液，PBS沖洗細胞兩次，加1mL 1%Triton X生理鹽水，4℃放置24h。超聲波處理20s，使細胞充分裂解，在倒置顯微鏡下觀察到細胞破碎；以離心半徑10cm，12 000r/m離心10min，堿性磷酸酶檢測試劑盒（磷酸苯二鈉法）測定上清液堿性磷酸酶活性，以上清液堿性磷酸酶的IU/g細胞蛋白表示堿性磷酸酶活性。

1.2.4 免疫印跡法測定蛋白表達 將VSMCs接種于60mm培養皿中，各組生長到80%時予不同處理后，使用冷PBS洗3次，加入裂解液后4℃靜置0.5h，以離心半 徑 10cm，12 000r/m 離 心10min，取上清液低溫冰箱保存備用；用BCA法進行蛋白定量后，總蛋白經SDS－PAGE電泳，轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉60min，然后加入適當比例一抗，4℃搖床過夜，TBST洗3次，5min/次。將PVDF膜用ECL發光液顯色，暗室曝光到X線片上，掃描后Imag J灰度分析結果，重復5次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，定量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，用SNK檢驗進行均數間的兩兩比較，檢驗水準α設定為0.05。

2 結果

2.1 高糖環境下VSMCs被誘導轉分化為成骨樣細胞

高糖處理VSMCs 3d或7d后，與對照組比較，β－甘油磷酸組、高糖組和高糖＋β－甘油磷酸組堿性磷酸酶活性、鈣含量以及骨分化標志蛋白Runx2表達均上調（圖1），上述結果提示高糖能誘導VSMCs從收縮表型轉分化為成骨樣表型。

2.2 4－PBA能阻斷高糖引起的VSMCs的ER應激和凋亡

與高糖＋4－PBA組比較，4－PBA組ER應激標志蛋白GRP78和CHOP表達下降，同時ER途徑凋亡標志蛋白Caspase－12表達均下降（圖2），差異有統計學意義（P＜0.05）。上述結果提示，高糖能引起VSMCs的ER應激和凋亡，ER應激和凋亡可能會介導VSMCs表型轉化。

2.3 ER應激在高糖引起的VSMCs鈣化中有重要作用

與高糖＋4－PBA組比較，4－PBA組堿性磷酸酶活性下降、鈣含量表達降低（圖3），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 高糖誘導VSMCs轉分化為成骨樣細胞

圖2 4－PBA能阻斷高糖引起的VSMCs的ER應激和凋亡

圖3 4－PBA能抑制高糖誘導的VSMCs成骨樣細胞轉分化

3 討論

糖尿病是對人類危害極大的代謝障礙疾病，糖尿病血管鈣化作為糖尿病常見的獨立并發癥之一，是心血管疾病高發病率和高病死率的獨立危險因素［1－2］。血管鈣化是 VSMCs類似于骨發育向成骨樣細胞轉分化的主動過程［4－5］。

研究［7－8］發現，糖尿病（體外高糖）狀態下能引起血管鈣化（VSMCs鈣化）和ER應激。為了探究ER應激以及凋亡在高糖下誘發VSMCs鈣化中的作用機制，本研究利用高糖處理大鼠VSMCs模擬機體糖尿病狀態，結果顯示：高糖處理能誘導VSMCs的ER應激反應和凋亡，4－PBA能阻斷VSMCs的鈣化（血管鈣化的重要過程），以上結果提示ER應激可能在 VSMCs的鈣化中有重要作用［9－10］，尤其是，4－PBA在抑制ER應激和凋亡的同時，也能阻斷VSMCs向成骨樣細胞的轉分化。

綜上所述，高糖處理VSMCs能引起ER應激和凋亡，也可誘導VSMCs轉分化為成骨樣細胞，引起VSMCs堿性磷酸酶活性增加、鈣含量和骨分化標志表達上調；另一方面，4－PBA不僅能抑制高糖誘導的VSMCs的ER應激和凋亡，而且也能阻斷VSMCs向成骨樣細胞的轉分化，也即證實了ER應激在高糖引起的VSMCs鈣化中起著重要作用。

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