SYBR Green實時熒光定量PCR法檢測人乳腺球蛋白在乳腺癌診斷中的應用＊

孫昌瑞，鄧 君，馮 林，洪 華，江詠梅

1.四川大學華西第二醫院 檢驗科（成都 610071）；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 檢驗科（成都 610072）；3.四川省婦幼保健醫院 檢驗科（成都 610000）

乳腺癌發病率較高，且呈不斷上升趨勢，早期即可發生微轉移，因此，乳腺癌相關基因的檢測對于早期診斷、防治復發和預后判斷等有重要意義。人乳腺球蛋白（human mammaglobin，HMAM）特異性表達于乳腺組織，對乳腺癌具較高診斷價值。目前常用免疫組織化學染色和RT－PCR等對HMAM mRNA進行檢測，上述方法存在標本來源困難，靈敏度較低，特異性較差，操作復雜，或需采用強誘變劑等缺點，而SYBR Green實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，FQ－PCR）具有高靈敏性、高特異性、高精確性、無污染和可定量等優點。本研究采用SYBR Green FQ－PCR檢測HMAM mRNA在外周血循環腫瘤細胞中的表達并分析其病理意義，同時與RT－PCR進行比較，以期為乳腺癌分子標志物的選擇及靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病例組選取2011年1月至2014年6月四川省人民醫院門診和住院部的相關女性患者共371例：良性乳腺疾病91例，年齡28～77歲，其中纖維瘤53例，脂肪瘤38例，并排除患其他腫瘤可能性；乳腺癌193例，年齡31～78歲；其他腫瘤患者87例，年齡32～81歲，其中結腸癌31例、肺癌26例、卵巢癌30例。所有研究對象的確診均根據病理學診斷結果。乳腺癌患者納入標準［1］：1）年齡≥18歲；2）可測量、可評價；3）預測壽命≥2個月；4）美國東部腫瘤協作組（eastern cooperative oncology group，ECOG）得分為0～2分；5）無嚴重衰竭性疾病；6）無第2個部位惡性腫瘤；7）接受了前期的輔助治療、放射治療；8）無任何轉移性疾病。

對照組隨機選擇同期健康女性體檢者，排除乳腺和卵巢疾病，且無乳腺癌和卵巢癌家族史，共45例，年齡27～75歲。

1.2 儀器和試劑

逆轉錄、FQ－PCR 體系、β－actin試劑盒和7500 FAST Sequence Detector分析儀（美國ABI公司）；RNA提取、cDNA的合成和PCR擴增試劑（上海生工生物公司）；IMMELITE WANG化學發光儀（天津得普）；全自動生化分析儀（日本奧林巴斯2700）。

1.3 SYBR Green FQ－PCR探針和引物

采用PE公司Primer Express軟件設計HMAM探針和引物，序列如下：HMAM引物正向，5′－GAGTTCATAGACGACAATGCC－3′，反向，5′－CCGTAGTTGGTTTCTCACCAT，β－actin－3′引物：正向，5′－CTCTTCCAGCCTTCCTT CCT－3′，反向，5′－AGCACTGTGTTGGCGTACA G－3′，由上海生工生物公司合成。

1.4 SYBR Green FQ－PCR反應

1）取靜脈血5mL，1mg/mL EDTA抗凝，棄去上方的1mL，防上皮細胞污染，采用一步法提取細胞總RNA。2）cDNA的合成：逆轉錄體系20μL：細胞總RNA 1μg，RNasin 20U，引物200ng，5×反應緩沖液4μL，M－MLV反轉錄酶20U，42℃反應55min。3）PCR：逆 轉 錄 產 物 5μL，探 針150nmol/L，引物各為400nmol/L，dATP、dCTP和dGTP各200μmol/L，dUTP 400μmol/L，10×緩沖液5μL，Taq DNA 聚合酶1.25U，MgCl25mmol/L，尿嘧啶 N－糖基化酶（UNG）0.5U。在7500FAST Sequence Detector分析儀上測定標準品和標本HMAM和β－actin含量。擴增參數為：50℃，2min；96 ℃，10min；再95 ℃30s，65 ℃1min，42個循環。儀器根據標準曲線自動計算HMAM和β－actin的拷貝數，以 HMAM 和β－actin比值作為HMAM的表達水平。

1.5 陽性判斷

應用2－ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量（Ct為循環閾值）。ΔCt值＝目的基因（HMAM）Ct值－β－actin基因 Ct值，以β－actin為對照；ΔΔCt＝乳腺癌組的ΔCt值－健康體檢組的ΔCt值，以健康體檢組為對照。45例健康人的基因表達相對量為1.003±0.087，2－ΔΔCt值為乳腺癌組基因相對健康體檢組基因表達的倍數，測定值以2－ΔΔCt＞2為表達陽性。陽性率＝陽性表達人數/總人數×100%。

1.6 RT－PCR

RNA提取、cDNA合成和PCR擴增的實驗方法均按照操作說明進行，引物與FQ－PCR相同，用瓊脂糖電泳法和溴化乙啶染色觀測結果。

1.7 CA153、CEA和TSGF的檢測

CA153和CEA采用化學發光法進行測定；TSGF采用酶連續監測法進行測定。

1.8 ER、RR和HER2的檢測

采用免疫組織化學Envision二步法，具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.9 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行數據分析。定性資料以例數和率表示，各組基因標志物表達陽性率的比較采用χ2檢驗，與臨床病理資料及受體表達的相關性分析采用Spearman等級相關分析，不同方法用于乳腺癌診斷的評價采用 McNemar檢驗。檢驗水準α設定為0.05。

2 結果

2.1 HMAM的表達

健康體檢者、良性乳腺疾病、其他腫瘤患者和乳腺癌患者 HMAM 陽性率分別為20.0%、31.9%、31.0%和42.0%，乳腺癌患者HMAM陽性率明顯高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其他腫瘤患者，差異有統計學意義（χ2＝5.153，3.797，4.875；P＝0.017，0.029，0.035）；良性乳腺疾病和其他腫瘤患者HMAM陽性率高于健康體檢者，差異有統計學意義（χ2＝4.103，4.031；P＝0.024，0.023）；良性乳腺疾病和其他腫瘤患者比較，差異無統計學意義（χ2＝1.069，P＝0.275）。

2.2 HMAM癌基因表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

193例乳腺癌患者HMAM表達陽性率與患者年齡、腫瘤大小、類型無關（rs＝1.203，1.022，1.021；P＝0.256，0.302，0.391）；與乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋窩淋巴結轉移呈正相關（rs＝5.023，6.236，5.389；P＝0.015，0.011，0.013）（表1）。

2.3 HMAM表達與激素受體的相關性

193例乳腺癌患者HMAM表達與雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達無明顯相關性（rs＝0.081，0.075；P＝0.324，0.395）；與 HER2/neu表達呈正相關（rs＝0.223，P＝0.012）（表2）。

表1 HMAM表達與乳腺癌患者臨床病理學特征的相關性［n（%）］

表2 乳腺癌HMAM表達與激素受體的相關性［n（%）］

2.4 SYBR Green FQ－PCR和 RT－PCR法用于乳腺癌微轉移診斷的評價

SYBR Green FQ－PCR檢測HMAM對乳腺癌診斷的靈敏度（χ2＝5.715，P＝0.0213）和特異性（χ2＝5.116；P＝0.0325）均高于 RT－PCR法，其差異有統計學意義（表3）。

表3 FQ－PCR和RT－PCR法靈敏度和特異性的比較

2.5 HMAM、CA153、TSGF和CEA對乳腺癌診斷的靈敏度和特異性

HMAM對乳腺癌診斷的靈敏度高于TSGF和CEA，差異有統計學意義（χ2＝4.179，4.251；P＝0.037，0.034），也高于 CA153，但差異無統計學意義（χ2＝2.801；P＝0.098）；特異性高于 CA153、TSGF 和 CEA（χ2＝4.279，4.901，5.231；P ＝0.031，0.027，0.024）（表3～表6）。

表4 CA153對乳腺癌診斷的靈敏度和特異性

表5 TSGF對乳腺癌診斷的靈敏度和特異性

表6 CEA對乳腺癌診斷的靈敏度和特異性

3 討論

HMAM基因定位于人染色體11q13區域，是子宮珠蛋白超家族成員之一，也是上皮組織來源的組織特異性標志［2］。HMAM基因所編碼的蛋白質氨基酸序列與子宮珠蛋白超家族同源，幾乎只在乳腺上皮細胞中表達并在乳腺癌組織中過表達，在骨髓中陽性表達預示預后較差。研究發現，HMAM可能與親脂素B蛋白通過二硫鍵形成異源二聚體而發揮作用，其異常表達與乳腺癌的微轉移和療效密切相關［3］。HMAM mRNA特異性表達于乳腺組織，而在其他腫瘤如肝癌、肺癌、結直腸癌、胃癌等均不表達［4］。

由于HMAM具有較高組織特異性，在乳腺癌微轉移中具較高潛在診斷價值，因此它一直是近年國內外研究較多的乳腺癌相關基因，Tjensvoll等［5］研究顯示，5例術前骨髓HMAM陽性表達患者，其中4例術后出現復發。進淑娟等［6］發現患者乳腺癌組織、腋窩淋巴結及外周血中HMAM mRNA表達與乳腺癌的臨床分期相關，提示HMAM檢測可以反映乳腺癌的微轉移。鮑慧錚等［7］在2014年報道，FQ－PCR檢測44例乳腺癌患者外周血HMAM 表達陽性率為38.6%，CK19和HMAM聯合檢測的陽性率為56.8%。

雖然國內外已有關于HMAM對乳腺癌輔助診斷的相關報道，但上述報道主要局限在乳腺癌和良性腫瘤患者，缺少與不同檢測方法的比較及于其他腫瘤標志物的比較等，且例數較少，本研究旨在較為全面地探討HMAM在乳腺癌輔助診斷中的意義。

本研究發現，乳腺癌患者HMAM陽性率明顯高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其他腫瘤患者（P＜0.05），表明 HMAM 可輔助乳腺癌的診斷。在與病理學特性的比較中，HMAM表達與乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋窩淋巴結轉移和HER2/neu表達相關；級別越高的腫瘤陽性率越高，腋窩淋巴結轉移者表達高于無轉移者。目前，用于乳腺癌診斷的腫瘤標記物主要有CA153、TSGF和CEA等，CA153是報道較多且對乳腺癌特異性較高的標志物，單獨應用時其靈敏度低，陽性率僅為22.5%～40.2%［8］；TSGF在惡性腫瘤形成早期，即釋放到血液中并達到一定濃度，是惡性腫瘤血管擴增的刺激因子和血管增生的物質基礎，而與非腫瘤血管增生無關［9－11］，雖然其靈敏度較高，但特異性差；CEA 的陽性率和特異性也較低。本研究發現，HMAM對乳腺癌診斷的靈敏度（42.0%）高于TSGF（33.7%）和CEA（30.6%），特異性（70.9%）高于 CA153（45.3%）、TSGF（39.0%）和 CEA（36.3%）。

SYBR Green FQ－PCR主要是利用Taq酶5′→3′外切酶活性，在常規PCR基礎上加入熒光標記探針進行核酸定量分析，與普通的RT－PCR法相比，具有以下優點：1）在PCR擴增對數期對mRNA的表達進行定量，結果更為可靠；2）擴增和檢測同時進行，減少了交叉污染；3）高靈敏性、高特異性和高精確性。本研究SYBR Green FQ－PCR對HMAM檢測靈敏度為42.0%，RT－PCR為30.1%，SYBR Green FQ－PCR對 HMAM 檢測特異性為70.9%，RTPCR為59.6%；4）高度自動化、快速，可縮短檢測時間1～2h。

綜上所述，SYBR Green FQ－PCR法能快速定量檢測外周血中HMAM的基因表達，具有高靈敏度、高特異性、高精確性、高效率和污染小等特點，且標本來源容易，可為乳腺癌的輔助診斷提供客觀可靠的依據。

［1］Strati A，Kasimir－Bauer S，Markou A，et al.Comparison of three molecular assays for the detection and molecular characterization of circulating tumor cells in breast cancer［J］.Breast Cancer Res，2013，15（2）：20.

［2］Watson MA，Fleming TP.Mammaglobin，a mammary－specific member of the uteroglobin gene family，is overexpressed in human breast cancer［J］.Cancer Res，1996，56（4）：860－865.

［3］Zuo L，Li L，Wang Q，et al.Mammaglobin as a potential molecular target for breast cancer drug delivery［J］.Cancer Cell Int，2009，9：8.

［4］楊紅，林德馨.人乳腺珠蛋白和親脂素B共轉染乳腺癌細胞T47－D［J］.福建醫藥雜志，2010，32（4）：63－65.

［5］Tjensvoll K，Gilje B，Oltedal S，et al.A small subgroup of operable breast cancer patients with poor prognosis identified by quantitative real－time RT－PCR detection of mammaglobin A and trefoil factor 1mRNA expression in bone marrow［J］.Breast Cancer Res Treat，2009，116（2）：329－338.

［6］進淑娟，黃焰，劉廣賢，等.人乳腺珠蛋白mRNA在腋窩淋巴結及外周血中的表達規律及其臨床意義［J］.軍事醫學科學院院刊，2010，34（5）：440－443.

［7］鮑慧錚，陳力，李思瑩，等.CK19聯合hMAM檢測乳腺癌循環腫瘤細胞的臨床價值［J］.腫瘤，2014，34（2）：153－157.

［8］王青民，陳傳剛.TSGF和CEA在晚期乳腺癌治療中的臨床意義［J］.腫瘤基礎與臨床，2010，23（2）：123－124.

［9］焦路陽，郭慶合，魯廣建，等.血清 TSGF、CA153、CA125、CEA聯合檢測在乳腺癌診斷中的應用［J］.現代預防醫學，2012，39（18）：4692－4693，4695.

［10］陳曄.CA125、CA19－9和TSGF聯合檢測在乳腺癌臨床診斷中的價值探討［J］.國際檢驗醫學雜志，2014，35（2）：235－236.

［11］Pathmanathan N，Bilous AM.HER2testing in breast cancer：an overview of current techniques and recent developments［J］.Pathology，2012，44（7）：587－595.