參七消痞丸有效成分提取工藝研究＊

童志遠，牟澤東，冉曉輝，顏曉燕△

1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 藥劑科（成都 610513）；2.成都醫(yī)學院 藥學院（成都 610083）；3.四川泰華堂制藥有限公司（廣漢 618300）

乳腺小葉增生是一種既非炎癥亦非腫瘤的慢性疾病，占乳房疾病的70%左右，多見于30～50歲的女性，發(fā)病率為20%～30%，部分地區(qū)甚至高達50%，癌變率為12.9%～21.9%［1］。參七消痞丸為成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自制制劑，具有多年的臨床應用基礎，其治療乳腺小葉增生效果顯著，無明顯不良反應，患者反饋好。該方主要由人參、三七、柴胡等9味藥材組成。目前，該藥劑型為大蜜丸，生產工藝較粗糙，質控標準不高，生產效率低，單劑量規(guī)格太大，病人服用不便，同時，由于大蜜丸制劑過程中加入了蜂蜜等輔料，糖尿病患者用藥受到限制。基于以上不足，本實驗通過對參七消痞丸有效成分提取工藝進行初步探索，以期為后期更改劑型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試劑材料：柴胡、人參、三七等藥材（購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司）；柴胡皂苷d對照品（購于成都曼斯特生物科技有限公司，生產批號MUST－14031208，純度≥98%）；甲醇（購于成都科龍化工試劑廠，生產批號2014040101），正丁醇（購于成都科龍化工試劑廠，生產批號2014040101），磷酸（購于成都科龍化工試劑廠，生產批號2014121101），對二甲氨基苯甲醛（購于天津市大茂化學試劑廠，生產批號20141120）。主要儀器：揮發(fā)油提取測定器（輕油），BUCHI旋轉蒸發(fā)儀R－210（瑞士步琦有限公司），ZDHW－調溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），YP2001N電子天平（上海精密科學儀器有限公司），紫外可見分光光度計（Alpha－1900S）。

1.2 方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油 本方中柴胡、郁金、莪術、香附等均含揮發(fā)油成分，可能是適應本癥的有效成分。因此，在水提取工藝條件篩選前，先對其揮發(fā)油提取工藝條件進行摸索［2－5］。根據處方量稱取藥材170g，剪為直徑約0.5cm的碎塊。選取揮發(fā)油提取時間和加水倍量（3、4、5倍）為考察因素，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，篩選參七消痞丸中揮發(fā)油提取的最佳工藝條件。從冷凝回流開始計時，每小時讀取1次揮發(fā)油體積，直至揮發(fā)油體積不再增加為止，平行實驗3次以上。每次實驗以揮發(fā)油最終體積為100%，每次所讀取的體積按其在終體積中所占百分比表示。

1.2.2 正交實驗法篩選最佳水提取工藝條件 立足傳統(tǒng)中醫(yī)理論中“君臣佐使”的理念對方中各藥所起的功效及在方中的地位進行分析，初步確定柴胡在本方中占有非常重要的地位。柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，同時也是柴胡中最重要的一類有效成分，主要含柴胡皂苷（saikosapoins a、b、c、d 4種），其中以a及d活性最強［6－7］。以柴胡皂苷d為檢測指標可間接反映柴胡總皂苷含量［8］。實驗最終選擇出膏率、柴胡總皂苷提取率和柴胡總皂苷含量作為主要的檢測指標并選取第1次煎煮加水倍量（3、4、5倍）、第2次煎煮加水倍量（6、8、10倍）、第3次煎煮時間（1、1.5、2h）為考察因素，通過正交實驗對提取揮發(fā)油以后的藥渣進一步進行水提取，篩選柴胡、郁金等7味藥材共煎的最佳水提取工藝條件（表1）。將提取揮發(fā)油后的藥渣過濾，收集煎煮液，藥渣依據L9（34）正交實驗表，按不同實驗水平下的加水倍量和煎煮時間，分別進行煎煮，最終收集煎煮液備用。

表1 L9（34）正交實驗因素水平

1.2.3 不同實驗水平下出膏率和柴胡總皂苷提取率 合并每個實驗水平下的煎煮液，充分搖勻，量取總體積1/2的煎煮液置于恒重的圓底燒瓶中，揮干水分，于60℃烘箱內干燥至連續(xù)兩次稱量質量差小于0.3mg，連續(xù)稱量3次結果取平均值。用重量差法求出干膏質量，由投料量求得出膏率。

另取剩余體積1/2的煎煮液用飽和正丁醇按1∶1比例連續(xù)萃取2次，每次1h，分離合并正丁醇萃取液置于恒重的圓底燒瓶中，揮干正丁醇，干燥至恒重。根據重量差法即得柴胡總皂苷質量，進而求得柴胡總皂苷提取率［9－10］。

1.2.4 紫外分光光度法測定柴胡總皂苷含量 1）標準曲線的制備：精密稱取柴胡皂苷d對照品10.32mg，適量甲醇溶解，轉移至5mL容量瓶中，加甲醇定容。精密吸取柴胡皂苷d對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于具塞試管中，甲醇分別定量至1.0mL。分別精密加入1%的對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液1.0mL，搖勻，在70℃水浴條件下反應10min，取出放冷。分別精密加入磷酸5.0mL，搖勻，在70℃水浴條件下反應30min，取出放冷，于536nm處測定吸光度［11］。繪制標準曲線，求出回歸方程：Y＝0.0006X－0.0645，R＝0.999。表明柴胡皂苷在（206.4～2064.0）mg/L范圍內成良好的線性關系。2）精密度實驗：精密吸取對照品溶液0.6mL，共5份，置具塞試管中，加甲醇至1.0mL，其余操作同“標準曲線的制備”，于536nm處測定吸收度。結果對照品的RSD為0.09%。3）穩(wěn)定性實驗：取精密度項下的第5號樣品于10、20、30、60、90、120min測定吸收度，RSD為6.25%，對照品溶液在顯色后20min內基本穩(wěn)定。4）重復性實驗：對同一樣品，平行取6份供試品溶液進行含量測定，結果平均含量為10.19mg/g，RSD為2.11%。5）加樣回收實驗：取已知含量的同一樣品9份，精密稱定，分別精密加入相同量的對照品溶液，其余操作同“標準曲線的制備”。于536nm處測定吸收度，計算回收率。平均回收率為99.06%，RSD 為0.96%（表2）。6）樣品含量測定：用適量甲醇將柴胡總皂苷樣品溶解，轉移至5mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別精密吸取0.4mL供試品溶液置于具塞試管中，加甲醇至1mL。其余操作同“標準曲線的制備”，反應后放冷，分別加入適量甲醇調節(jié)各供試品溶液濃度，使其在536nm處吸光度在0.2～0.8之間，每個樣品平行測定3次，取平均值，根據標準曲線求得每個樣品中柴胡總皂苷的百分含量［12－14］。

表2 加樣回收率實驗

2 結果

2.1 揮發(fā)油提取工藝篩選結果

實驗采用水蒸氣蒸餾法對參七消痞丸處方中揮發(fā)油提取條件進行摸索，結果顯示提取時間達6h后，揮發(fā)油量基本不再增加，且提取揮發(fā)油的加水倍量對揮發(fā)油提取影響不大（表3）。

表3 不同時間出油量及出油率

2.2 正交實驗法篩選最佳水提取工藝條件結果

分別選取出膏率、柴胡總皂苷提取率及柴胡總皂苷含量中的最大值設定為100%，其余結果分別按其所占百分比表示。根據各考察指標的重要程度，取出膏率的權ω1＝0.3；柴胡總皂苷提取率的權ω2＝0.4；柴胡總皂苷含量的權ω3＝0.3。按公式：實驗得分＝∑i（ωi×第i個指標）得各號實驗的綜合得分（表4）。因素水平中最大的綜合平均值與最小的綜合平均值之差稱為因素的極差，極差的大小反映了因素對指標的影響程度，用R表示。由綜合平均值的大小選取各因素的最佳水平組合，綜合平均值越大，水平越優(yōu)，各因素最優(yōu)水平組合在一起即為最佳實驗方案。利用綜合得分值計算各因素的綜合平均值和極差。第1次煎煮加水倍量、第2次煎煮時間、第2次煎煮加水倍量3個因素的極差分別為0.049、0.229、0.179。說明這3個因素對總指標的影響次序為：第2次煎煮時間＞第2次煎煮加水倍量＞第1次煎煮加水倍量。3個因素水平綜合平均值的最大值分別為iii＝0.738、ii＝0.822、iii＝0.807（表5）。表明各因素水平的較優(yōu)搭配為3～2～3，即第1次煎煮加水倍量為5倍、第2次煎煮時間為1.5h、第2次煎煮加水倍量為10倍。

為驗證正交實驗考察得到的最佳提取工藝組合的合理性和可靠性，在3～2～3條件下重復實驗3次，其平均出膏率、平均柴胡總皂苷提取率、平均柴胡總皂苷含量分別為31.63%、4.02%、1.57%，綜合評分結果為0.97，表明該提取工藝組合效果較好，并且3次實驗結果較穩(wěn)定，說明該工藝組合可靠（表6）。

表5 綜合評分分析結果

表6 驗證實驗結果

3 討論

現代醫(yī)學認為乳腺小葉增生主要是卵巢功能失衡，黃體酮分泌低下，雌激素分泌過高，促使乳腺增生增殖.逐步累積而發(fā)病。中醫(yī)學認為本病屬“乳癖”范疇，明代陳氏在《外科正宗》中指出：“乳癖及乳中結核，形如丸卵，或墮作痛或不痛，皮色不變，其核隨喜怒消長，多由思慮傷脾，怒惱傷肝，郁結而成也”。祖國醫(yī)學認為，乳房乃肝經所布之處，七情內傷，肝氣郁結則氣滯血瘀，肝旺乘脾，脾失健運，聚濕生痰，痰氣互結，瘀阻乳絡而致乳癖。對于乳腺增生病的治療，西醫(yī)多采用3～6個月隨訪1次的方法，動態(tài)觀察病情，或用激素類藥進行治療，必要時行手術治療。中醫(yī)治療則主張針對疾病的發(fā)病原因和證型進行辨證論治，治療以疏肝理氣、活血化瘀、祛痰散結為主［15］。

“參七消痞丸”是我院使用多年的中藥自制制劑，該方主要由人參、三七、柴胡、香附、郁金等9味藥組成，其功能主治為：疏肝理氣、活血化瘀。通過多年用于乳腺小葉增生的臨床治療，反饋較好，效果顯著且無明顯不良反應。原方制劑為大蜜丸劑型，無論在制備技術還是質量控制等方面都存在不少問題。蜜丸由原藥粉加蜂蜜直接制成，在體內的吸收不完全，影響藥效的充分發(fā)揮。隨著現代科學技術的發(fā)展和臨床需要，重要劑型改進取得了飛速發(fā)展，由以前的丸、散、膏、丹發(fā)展為膠囊劑、濃縮丸、微丸、滴丸、注射劑等。中藥改進劑型的意義在于提高療效，擴大應用范圍。中藥有效成分提取的常用方法有：浸漬法、煎煮法、回流提取法、超臨界流體萃取法、超聲波協助溶劑提取法和微波協助溶劑提取法等。本研究綜合考慮生產成本和現有生產條件等因素，采用水蒸氣蒸餾法提取該方中揮發(fā)性成分；同時，選取了可行性較好、生產成本較低、工藝較為簡便的水提取法對參七消痞丸中的其他有效成分進行提取。由于本研究旨在初步探究參七消痞丸有效成分提取的較優(yōu)工藝條件，為后續(xù)改劑研究提供參考；因而，僅選取了出膏率、柴胡總皂苷提取率和柴胡總皂苷含量3個較為粗略的指標進行考察。我們在此基礎上，后期將對整個提取工藝及改劑過程建立更為詳盡的質控標準。此外，擬通過細胞水平及整體動物水平實驗來研究其與傳統(tǒng)劑型在藥效學上的差異，以期為其改劑可行性提供更為可靠的實驗依據。

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