蒲葵子乙醇提取物對人肝癌BeI-7402細胞增殖和遷移的影響

劉俊斌，吳衛紅，靳君華

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院門診辦公室，內蒙古 呼和浩特 010050）

·論著·

蒲葵子乙醇提取物對人肝癌BeI-7402細胞增殖和遷移的影響

劉俊斌1，吳衛紅2，靳君華1

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院門診辦公室，內蒙古 呼和浩特 010050）

目的研究蒲葵子乙醇提取物（EELC）對人肝癌Bel-7402細胞增殖和遷移的影響。方法將培養的Bel-7402細胞隨機分為5組：對照組、150μg/ml EELC處理組、300μg/ml EELC處理組、10μmol/L Notch抑制劑DAPT處理組和10μg/ml抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體處理組，分別處理后，采用MTT和劃痕實驗檢測各組細胞增殖和遷移能力的變化，Western blot檢測各組細胞內VEGF、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）及Notch胞內片段（NICD）等蛋白表達的變化，ELISA檢測各組細胞分泌VEGF水平的變化。結果不同濃度EELC、DAPT和抗VEGF抗體處理Bel-7402細胞后，Notch-VEGF途徑相關的VEGF、MMP-2、NICD等蛋白表達水平、VEGF分泌量、細胞的增殖和遷移能力均受到不同程度地抑制（P＜0.05）。而且EELC的抑制作用呈現一定的濃度依賴性和時間依賴性。結論蒲葵子乙醇提取物可通過Notch-VEGF途徑抑制人肝癌Bel-7402細胞的增殖和遷移。

蒲葵子；人肝癌細胞系；Notch-VEGF；增殖；遷移

蒲葵子為棕櫚科蒲葵的種子，味淡，性平，甘澀，微毒。南方民間有用蒲葵子治療癌癥的歷史，現也已有不少關于蒲葵子抗癌活性和抗血管生成作用的相關研究報道[1-3]，尤其是蒲葵子的乙醇提取物具有較強的抗腫瘤作用[4]。肝癌是全球第三大致死癌癥，具有惡性程度高，易轉移復發等特點[5]。目前，在肝癌診治方面已取得較大進展，但關于肝癌的轉移機制仍需進一步闡明。

大量研究表明，腫瘤轉移的發生、發展總是伴隨著新生血管的形成，如果沒有新血管的形成，腫瘤會處于生長抑制狀態，甚至發生退化。如今，腫瘤轉移中的血管生成已作為抗癌治療的一個重要靶點，尤其在阻斷Notch和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路方面[6]。Notch和VEGF通路的相互作用方式為相互調節，既有區別，又協同[7]。關于Notch和VEGF通路參與肝癌轉移發生發展的研究已有相關報道，體內實驗研究提示，蒲葵子可通過下調Notch通路來抑制肝癌轉移的血管生成[4]，而關于蒲葵子針對肝癌細胞遷移機制的體外實驗研究少有報道。因此，本實驗擬以人肝癌細胞系Bel-7402為研究對象，在不同濃度蒲葵子乙醇提取物（ethanol extract of Livistona chinensis seeds，EELC）、DAPT或抗VEGF抗體處理下，分別采用MTT、Western blot、ELISA和劃痕實驗等方法，檢測Notch和VEGF通路相關的分子表達，以此探究蒲葵子對Bel-7402細胞增殖和遷移能力的影響和分子機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

人肝癌細胞株Bel-7402購于美國ATCC細胞庫，RPMI-1640培養基為美國GIBCO公司產品，蒲葵子購于西南偏冷草藥房，人VEGF ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，HRP-標記的山羊抗鼠二抗和HRP-標記的山羊抗兔二抗購于江蘇碧云天生物技術研究所，鼠抗人NICD抗體、兔抗人VEGF抗體為美國Abcam公司產品，兔抗人MMP-2抗體和兔抗人β-actin為美國Santa Cruz公司產品，DAPT、MTT及DMSO為美國Sigma公司產品，胰酶為美國Invitrogen公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1溶液配制將蒲葵子分別用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，分別合并提取液，濃縮，冷凍干燥，備用。取一定量的EELC干粉，用DMSO和無水乙醇等體積溶解，配制600 g/L EELC儲液，無菌過濾。用DMSO配制20 mmol/L DAPT儲液。

1.2.2細胞培養和分組Bel-7402細胞用含10%滅活胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基，在37℃、5%二氧化碳（CO2）條件下進行培養。根據細胞生長情況，更換培養基，取對數生長期細胞用于實驗。以下各實驗的細胞均分為5組，對照組（細胞+培養基）、150μg/ml EELC處理組（細胞+培養基+EELC）、300μg/ml EELC處理組（細胞+培養基+EELC）、10μmol/L DAPT處理組（細胞+培養基+DAPT）和10μg/ml抗VEGF抗體處理組（細胞+培養基+抗VEGF抗體），各組細胞用相應處理的培養基孵育時間一致。

1.2.3MTT檢測細胞增殖活性將Bel-7402細胞按1×104個/孔的密度接種于96孔板，每孔200μl培養基，24h后換液，并按24h和48h時間點培養細胞，各自分5組，分別加180μl相應處理的含血清培養基，每組設6個復孔。分別在24和48 h時間點，收集上清液，同時向待測孔加入20μl MTT溶液（5 g/L），37℃，4 h。棄上清液，每孔加入150μl DMSO，溶解后，酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光值（OD值），并按公式計算各組的細胞活性：細胞相對活性=處理組平均OD值/對照組平均OD值× 100%。

1.2.4Western blot檢測Notch-VEGF途徑相關蛋白表達將Bel-7402細胞按4×105個/孔的密度接種于6孔板，24 h后換液，進行無血清RPMI 1640培養24 h之后，向各組中分別加相應處理的無血清培養基。作用24 h后，提取細胞全蛋白，Western blot法檢測VEGF、MMP-2、NICD等蛋白的表達。

1.2.5ELISA檢測細胞VEGF分泌水平按1.2.3方法獲取相應處理后的上清液，置于4℃冰箱保存，10 000 r/min，離心10 min，收集上清液，用BCA法檢測蛋白的濃度。另取各組部分上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，最后酶標儀檢測，讀取450 nm處的OD值，繪制標準曲線，計算各組細胞分泌上清液中每1 mg蛋白中的VEGF含量。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞遷移能力將Bel-7402細胞按4×105個/孔的密度接種于6孔板，待細胞長至80%左右匯合時換液，進行無血清RPMI 1640培養24 h。然后用200μl無菌槍頭在單層細胞上劃

痕，PBS洗去漂浮細胞，后向各組中分別加相應處理的無血清培養基培養。在劃痕后0、24 h時間點，均通過倒置顯微鏡和電腦軟件在同一位置觀察劃痕區域的細胞遷移情況，并計數。

1.3統計學方法

實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同處理對BeI-7402細胞增殖情況的影響

MTT結果顯示，在24和48 h時間點，與對照組比較，EELC、DAPT和抗VEGF抗體組的細胞增殖均受到了不同程度的抑制（P＜0.05），而且隨著作用時間的延長，抑制效果更加明顯。同時，EELC對該細胞增殖的抑制作用隨劑量的增加而增強，300μg/ml、48 h EELC處理對Bel-7402細胞有極其顯著的增殖抑制作用，細胞相對活性低至31%。見圖1。

圖1 不同處理對BeI-7402細胞增殖的影響

2.2不同處理對BeI-7402細胞Notch-VEGF途徑相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與對照組比較，EELC、DAPT和抗VEGF抗體組的細胞VEGF、MMP-2、 NICD等蛋白表達量均明顯下調（P＜0.05），并且高濃度的EELC比低濃度的EELC對3種蛋白表達的下調作用更顯著，有著明顯的濃度-效應依賴關系。見圖2。

圖2 不同處理對BeI-7402細胞VEGF、MMP-2、NICD蛋白表達水平的影響

2.3不同處理對BeI-7402細胞分泌VEGF水平的影響

ELISA結果顯示，見圖3，在24和48 h時間點，EELC、DAPT和抗VEGF抗體等處理均能不同程度地降低Bel-7402細胞分泌VEGF水平，與同樣時間條件下的對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。而且，EELC濃度越高，相應組細胞培養上清液中的VEGF含量越低。此外，隨著作用時間的延長，各組

細胞的VEGF分泌量反而略有下降。

2.4不同處理對BeI-7402細胞遷移能力的影響

劃痕24 h后，各組細胞均有不同數量的遷移，但對照組的細胞遷移現象最為明顯，各處理組的細胞發生遷移的數目明顯低于對照組（P＜0.05）。EELC、DAPT和抗VEGF抗體等處理對Bel-7402細胞的遷移能力都是有所抑制，并且該細胞的遷移能力與EELC濃度呈負相關。見圖4。

圖4 不同處理對BeI-7402細胞遷移能力的影響（×200）

3 討論

腫瘤細胞的增殖和遷移是肝癌患者死亡的的首要原因，也是臨床治療易復發，預后差的主要原因[8]。在肝癌發生、發展過程中，肝癌細胞中的VEGF、MMP-2和NICD蛋白表達量相比于正常細胞均顯著上調，與本實驗結果一致。其中，VEGF是作用最強的血管生成因子，與肝癌細胞的遷移有關，可通過旁分泌途徑誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤生長；也可作為一種自分泌生長調節因子而直接刺激腫瘤生長。同時它還能誘導血管內皮細胞產生MMP-2等降解細胞基底膜和細胞外基質的蛋白水解酶，從而有利于肝癌細胞遷移進入脈管系統，促進血管內皮細胞增殖和血管形成。因此，VEGF幾乎參與整個血管新生的病理生理過程。而NICD是Notch信號通路激活后，細胞表面的Notch受體與配體結合，在γ-分泌酶的水解作用下，Notch受體的胞內段被切割而形成的片段產物，隨后該片段進入細胞核，作用于下游基因，從而產生各種生物學效應。總之，VEGF通路與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、血管形成以及復發密切相關；Notch通路則是結構高度保守的經典信號通路，參與生物個體發育和腫瘤不同發生發展的過程。

該實驗發現，EELC作用能明顯抑制Bel-7402

細胞的增殖和遷移水平，有一定的濃度依賴性和時間依賴性，說明蒲葵子在調控肝癌細胞的增殖和遷移能力有一定的抑制作用。抑制Notch或者VEGF通路也均使Bel-7402細胞的增殖作用和遷移水平明顯降低，說明在抑制肝癌細胞增殖和遷移方面，蒲葵子、Notch抑制劑DAPT和抗VEGF抗體3者是有相同的抑制作用。另外，在EELC、DAPT和抗VEGF抗體分別作用下，Bel-7402細胞的VEGF分泌水平都明顯降低，提示蒲葵子的抗腫瘤機制可能通過降低細胞分泌VEGF，而抑制內皮細胞VEGF受體表達，從而干預VEGF和Notch信號轉導通路的實現。

本研究表明，蒲葵子可通過下調Notch通路來抑制肝癌轉移的血管生成[4]；VEGF通路抑制劑能明顯抑制VEGF引發的主動脈環微血管形成和植入的人工基底膜新血管形成[9]；在Notch信號上調的腫瘤發生中，抑制Notch通路可能加強VEGF抑制劑作用[10]；同時抑制Notch和VEGF通路并不影響腫瘤重量，但會導致血管退化，降低腫瘤活性，遠高于單獨抑制某一通路的效果[7]。可見Notch和VEGF通路在促進肝癌細胞遷移和腫瘤血管形成上是有共同之處的，并且蒲葵子很可能是通過Notch-VEGF途徑來實現對肝癌細胞增殖和遷移的抑制。

本研究表明，抑制肝癌細胞Notch通路會導致VEGF表達下調[11]，VEGF的表達也可影響Notch通路[12]，可見Notch和VEGF信號通路是相互作用、相互調節的作用方式。而抗VEGF抗體可以中和VEGF的作用，抑制其與受體結合，從而抑制腫瘤細胞生長；Notch抑制劑DAPT則可下調Notch通路。本實驗中，將不同濃度EELC、DAPT或者抗VEGF抗體分別與Bel-7402細胞共培養24 h后，檢測到NICD、MMP-2和VEGF蛋白表達顯著下調，即Notch和VEGF通路均明顯受到抑制，進一步證實Notch和VEGF通路主要是通過相互作用來調節肝癌細胞的增殖和遷移能力，并且蒲葵子作用于Bel-7402細胞，可通過下調Notch和VEGF通路，進而抑制肝癌細胞的的增殖和遷移。

綜上所述，Bel-7402細胞中的Notch-VEGF信號通路處于激活狀態。其中VEGF、MMP-2和NICD等分子均為高表達，VEGF分泌量、細胞增殖和遷移能力也均處于較高水平。而蒲葵子可通過Notch-VEGF途徑能明顯抑制VEGF、MMP-2和NICD等相關分子表達，并使人肝癌細胞Bel-7402的增殖和遷移能力明顯降低，且表現為一定的濃度依賴性和時間依賴性。因此，蒲葵子作用可顯著降低肝癌細胞的增殖和遷移能力，抑制血管形成和肝癌轉移，這無疑為今后蒲葵子應用于肝癌靶向藥物的開發研究提供實驗基礎，也可能為肝癌治療提供一條新途徑。

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（劉東京 編輯）

Effects of Livistona chinensis seeds on proliferation and migration of hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells

Jun－bin LIU1,Wei－hong WU2,Jun－hua JIN1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery,2.Outpatient Office,the Affiliated Hospital,Inner Mongolia Medical University,Huhhot,Inner Mongolia 010050,P.R.China)

【Objective】To study the effect of ethanol extract of Livistona chinensis seeds(EELC)on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel－7402 cells.【Methods】Cultured Bel－7402 cells were randomized into five groups:control group,150 μg/ml EELC group,300 μg/ml EELC group,10 μmol/L DAPT group and 10 μg/ml anti－vascular endothelial growth factor(VEGF)group.After treatment,cell proliferation was determined by MTT assay and cell migration by wound－healing assay.Furthermore,the expressions of VEGF,matrix metalloproteinase－2(MMP－2)and Notch intracellular domain(NICD)in Bel－7402 cells were evaluated by Western blot,and the secretion of VEGF protein was detected by ELISA.【Results】Treatments with different concentrations of DAPT,anti－VEGF antibody and EELC inhibited the proliferation and migration of Bel－7402 cells,as well as the expressions of VEGF,MMP－2 and NICD proteins(P＜0.05). Additionally,EELC inhibited cell proliferation and migration as well as gene expressions in a dose－and time－dependent manner.【Conclusion】EELC may inhibit the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel－7402 cells through Notch－VEGF pathway.

Livistona chinensis seed;Bel－7402 cell line;Notch－VEGF;proliferation;migration

R735.7

A

1005-8982（2015）24-0014-05

2015-04-14