慢性高原病患者骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白的表達研究*

張朝霞，崔森，張萍，王花，劉芳

（1.青海衛生職業技術學院臨床醫學系，青海 西寧 810000；2.青海大學附屬醫院血液科，青海 西寧 810001）

·臨床論著·

慢性高原病患者骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白的表達研究*

張朝霞1，崔森2，張萍1，王花1，劉芳1

（1.青海衛生職業技術學院臨床醫學系，青海 西寧 810000；2.青海大學附屬醫院血液科，青海 西寧 810001）

目的研究Bcl-w和Bid蛋白在慢性高原病（CMS）患者骨髓組織中的表達情況，探討它們在CMS發生、發展過程中的作用。方法選取18例CMS患者為CMS組，應用免疫組織化學SABC法檢測骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白的表達情況。16例單純陳舊性骨折患者為對照組。結果CMS組骨髓組織中Bcl-w及Bid蛋白陽性表達率分別為77.78%及11.11%，對照組骨髓組織中Bcl-w及Bid蛋白陽性表達率分別為31.25%及50.00%，CMS組骨髓組織中Bcl-w蛋白陽性表達率明顯高于對照組（P＜0.05）；而CMS組骨髓組織中Bid蛋白陽性表達率明顯低于對照組（P＜0.05）。CMS組Bcl-w、Bid陽性系數分別為（4.15±2.11）及（0.33±0.18），對照組Bcl-w、Bid陽性系數分別為（0.87±0.43）及（0.93±0.51），差異有統計學意義（P＜0.05）。CMS組Bcl-w蛋白表達陽性系數與血紅蛋白濃度呈正相關（r=0.835，P＜0.05），而Bid蛋白陽性系數與血紅蛋白濃度呈負相關（r=-0.659，P＜0.05）。結論CMS患者骨髓組織抗凋亡蛋白Bcl-w表達增高，促凋亡蛋白Bid表達降低，Bcl-w和Bid蛋白表達變化與CMS骨髓紅細胞凋亡異常有關。

慢性高原病；Bcl-w；Bid；細胞凋亡

慢性高原病（chronic mountain sickness，CMS）是生活于2 500米以上地區的世居和長期移居居民，對高原低氧環境逐漸失去習服而發生的臨床綜合征，又稱Monge病，曾稱高原紅細胞增多癥（high altitude polycythemia，HAPC），以過度紅細胞積累和嚴重低氧血癥為特征[1]。CMS的發病機理尚未完全闡明，既往研究肯定了紅細胞增殖在CMS發病中的作用，但對細胞凋亡方面的研究非常有限，細胞凋亡與細胞增殖一樣，在機體中發揮著重要的調控作用，可能在CMS的發生發展中發揮著重要作用。近期對其骨髓細胞凋亡的研究受到高度關注，發現CMS患者骨髓造血細胞凋亡減少[2-3]，而且CMS骨髓細胞凋亡減少的分子機制可能涉及到Fas/FasL、TNF/TNFR信號系統以外的其他凋亡分子和途徑[4]。Bcl-2家族中家族中的Bcl-w和Bid蛋白是細胞凋亡的關鍵調節蛋白，與線粒體依賴的細胞凋亡有關。本研究通過免疫組織化學SP法檢測CMS患者骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白表達水平變化，探討他們在CMS發生、發展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

18例男性CMS患者（CMS組），年齡（42.8±11.5）歲，均長期居住在海拔2 800～4 500米地區。CMS組患者血紅蛋白（HGB）濃度（235.6±16.4）g/L，符合第六屆國際高原醫學和低氧生理學學術大會《慢性高原病青海診斷標準》確診[1]。對照組選取同海拔地區16例單純陳舊性骨折患者，年齡（43.5±11.1）歲，均為男性，研究對象均排除各種急、慢性感染及原發性心、肺、肝、腎疾患。本研究經過青海大學附屬醫院醫學倫理委員會同意，并取得研究對象的知情同意。兩組間年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2標本采集及處理

采集空腹靜脈血2 ml注入含有EDTA的試管中充分混勻，行血細胞學分析。行骨髓活檢術取骨髓組織，標本經10%中性甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣，石蠟包埋，4μm厚連續切片。

1.3實驗方法

應用免疫組織化學SP法檢測骨髓組織Bcl-w和Bid蛋白，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，具體操作步驟按說明書進行。

1.4BcI-w和Bid染色結果判定

所有染色切片均由3人計數1 000個細胞中陽性細胞數，每份樣本用雙盲法閱片2次，取平均值。Bcl-w和Bid蛋白主要存在于細胞漿，陽性表達為棕黃色顆粒。為精確判斷蛋白的表達程度及減少假陽性率，記分標準參照許良中等[5]的方法，根據細胞漿的著色程度及著色細胞的百分率進行評分，并計算陽性系數（評分標準見表1）。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分各自相乘，即為陽性系數。陰性是指陽性系數為0、1分者，2、3分為（+），4～6分為（++），如為9分為（+++）。

1.5統計學方法

采用SPSS 15.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，顯著性檢驗用t檢驗和Fisher確切概率法，兩指標間相關性分析用直線相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 免疫組織化學染色記分標準

2 結果

2.1CMS組及對照組Bid和BcI-w的表達

CMS組和對照組骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白表達情況見表2～4。CMS組Bcl-w蛋白表達陽性率和陽性系數均高于對照組（P＜0.05）；CMS組Bid蛋白表達陽性率和陽性系數分別低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表3、4）。CMS組及對照組Bcl-w和Bid蛋白表達見圖1。

2.2BcI-w和Bid蛋白表達與血紅蛋白（Hb）之間的相關性

CMS組中，Bcl-w蛋白表達陽性系數與Hb濃度間呈顯著正相關（r=0.835，P＜0.05），見圖2；Bid蛋白表達陽性系數與Hb濃度間呈顯著負相關（r=-0.659，

P＜0.05），見圖3所示；Bcl-w與Bid蛋白陽性系數間未發現明顯相關性（P＞0.05）。

表2 骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白的表達情況例（%）

表3 骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白陽性表達情況

表4 骨髓組織中Bid和BcI-w蛋白表達陽性系數

圖1 BcI-w和Bid蛋白在骨髓組織中的表達（免疫組織化學SP法DAB染色標尺示50μm）

圖3 CMS組Bid與Hb關系散點圖

3 討論

CMS發病機制復雜，人們從紅細胞生物學特性、種族差異性、基因[6]、VEGF[7]、端粒酶等不同角度多方面研究高原適應及CMS的發病機制。CMS的根本原因是高原低氧，大量研究證明低氧可造成線粒體損傷，線粒體跨膜電位破壞，離子流動變化，而致呼吸鏈破壞，更重要的是釋放凋亡相關的分子如Smac/ DIABLO、HtrA2/Omi和細胞色素C等而促進細胞凋亡[8-9]。從理論上說，低氧可誘導或促進細胞凋亡，但對于CMS來說，骨髓細胞凋亡的調節機制更為復雜。近幾年對CMS發病機制的研究顯示，CMS患者有核紅細胞凋亡指數下調[2-4]，其機制與Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-XL[10]、Bax、Bid[3]及Bak[11]表達異常有關。低氧誘導缺氧誘導因子高表達可廣泛激活許多缺氧反應基因（HRGs），眾多的HRGs傳導細胞增殖信號，促進紅細胞增殖的同時也傳導抗凋亡信號而抑制細胞凋亡。Bcl-w主要分布于線粒體膜上，維持線粒體膜穩定性，阻止線粒體釋放凋亡相關分子而發揮抗凋亡作用[12]，與細胞色素C線粒體途徑的細胞凋亡密切相關。而造血干細胞因子可上調Bcl-w，通過對抗細胞凋亡而發揮對造血細胞的正調節作

用。線粒體途徑可以通過利用caspases與促凋亡蛋白之間的相互作用實現細胞凋亡的調節[13]。激活的caspase-8能使胞質中的Bid斷裂成tBid，tBid轉移到線粒體上，誘導細胞色素C從線粒體釋放進人胞質，從而把死亡受體通路和線粒體通路聯系起來，有效地擴大了凋亡信號。活化的Bid蛋白可通過與Bcl-2、Bcl-XL及Bc1-w等結合，減弱其抑制凋亡作用而促進細胞凋亡[14]；活化的Bid蛋白也可與Bax、Bak等結合，使Bax、Bak插人線粒體膜，從而誘導線粒體蛋白的釋放，促進細胞凋亡[15-16]。

本研究結果顯示，CMS患者骨髓組織中凋亡相關蛋白Bcl-w表達增高，Bid表達降低，提示線粒體途徑參與了CMS凋亡下調機制。研究結果還顯示CMS患者骨髓組織中Bcl-w表達升高且與血紅蛋白濃度間呈正相關，Bid表達降低且與血紅蛋白濃度間呈負相關，提示CMS患者骨髓紅細胞凋亡下調的機制與Bcl-w及Bid表達異常有關，由此引起的骨髓造血細胞凋亡下調與紅細胞增殖增強在CMS發病中起協同促進作用，提示線粒體途徑細胞凋亡信號變化與CMS骨髓細胞凋亡異常可能有著一定的關系。今后將進一步研究CMS骨髓造血細胞凋亡、下調及Bcl-2家族蛋白表達變化的機制，為開展CMS干預性研究提供理論依據。

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（劉東京 編輯）

Expressions of Bcl-w and Bid proteins in bone marrow of patients with chronic mountain sickness*

ZHao－xia ZHANG1,Sen CUI2,Ping ZHANG1,Hua WANG1,Fang LIU1
(1.Department of Clinical Medicine,Health Professional Technological College of Qinghai, Xining,Qinghai 810000,P.R.China;2.Department of Hematological,the Affiliated Hospital,Qinghai University,Xining,Qinghai 810001,P.R.China)

【Objective】To study the expressions of Bcl－w and Bid in bone marrow tissue of patients with chronic mountain sickness(CMS),and explore their possible roles in the developing process of CMS.【Methods】The samples of bone marrow used in this study were obtained from 18 patients with CMS(CMS group)and 16 patients with old fracture(control group).The expressions of Bcl－w and Bid in the bone marrow tissues were detected using the SP immunohistochemistry technique.The results were analyzed and compared between both groups.【Results】The positive rates of Bcl－w and Bid proteins were 77.78%and 11.11% in the CMS group,and 31.25%and 50.00%in the control group,respectively.The expression of Bcl－w in the CMS patients was significantly higher than that in the controls(P＜0.05),but the expression of Bid in the control group was much higher than that in the CMS group(P＜0.05).The positive coefficient of Bcl－w protein in the CMS group was significantly higher than that in the control group[(4.15±2.11)vs(0.87±0.43),P＜0.05].The positive coefficient of Bid protein in the control group was significantly higher than that in the CMS group[(0.93±0.51)vs(0.33±0.18),P＜0.05].In the CMS group,hemoglobin(Hb)value was positively correlated with Bcl－w protein and negatively correlated with Bid protein(r=0.835,－0.659respectively,both

chronic mountain sickness;Bcl－w;Bid;apoptosis

R594

A

1005-8982（2015）24-0019-04

2015-04-20

青海省衛生廳2012年醫藥衛生科研指導性計劃課題

P＜0.05).【Conclusion】The over－expression of Bcl－w and low－expression of Bid might be involved in mechanism of the change of erythroblast apoptosis in CMS patients.