布地奈德對哮喘小鼠氣道上皮細胞閉鎖蛋白表達的影響*

游曼清，鄧俊，梁宇佳，熊瑛，熊彬，王宋平

（1.四川省樂山市人民醫院呼吸內科，四川 樂山 614000；2.瀘州醫學院附屬醫院呼吸一科，四川 瀘州 646000）

·論著·

布地奈德對哮喘小鼠氣道上皮細胞閉鎖蛋白表達的影響*

游曼清1，鄧俊2，梁宇佳2，熊瑛2，熊彬2，王宋平2

（1.四川省樂山市人民醫院呼吸內科，四川 樂山 614000；2.瀘州醫學院附屬醫院呼吸一科，四川 瀘州 646000）

目的觀察哮喘小鼠氣道上皮細胞閉鎖蛋白的表達及布地奈德對其表達的影響。方法將24只雌性BALB/c小鼠隨機分為哮喘模型組、布地奈德組及對照組，每組8只。對照組用生理鹽水，哮喘模型組和布地奈德組用卵清蛋白腹腔注射致敏及霧化吸入激發建立哮喘模型，布地奈德組每次激發前1 h吸入布地奈德混懸液1 mg，連續14 d。對照組和哮喘模型組用等量生理鹽水代替布地奈德，吸入方法和時間同布地奈德組。小鼠末次激發24 h后，計數支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的嗜酸性粒細胞（EOS），HE和PAS染色觀察支氣管及周圍肺組織的病理改變、杯狀細胞增生和黏液分泌；電鏡觀察氣道上皮的超微結構；免疫組織化學和熒光定量PCR檢測氣道上皮occludin的表達。結果與對照組比較，哮喘模型組小鼠BALF中EOS計數、氣道上皮杯狀細胞數及病理學評分明顯增高；支氣管肺組織occludin蛋白表達明顯減弱，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與哮喘模型組比較，布地奈德組EOS和杯狀細胞計數及病理學評分明顯降低，occludin蛋白表達增強，差異均有統計學意義（P＜0.01）。哮喘模型組氣道上皮細胞間的連接結構不完整，細胞間隙增寬，而布地奈德組上述表現較哮喘組減輕。結論布地奈德能上調哮喘小鼠氣道上皮occludin的表達、促進受損氣道上皮的修復，可能是吸入型糖皮質激素治療哮喘的機制之一。

布地奈德；哮喘；氣道上皮細胞；緊密連接；閉鎖蛋白

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種氣道慢性炎癥性疾病，其發病機制復雜，至今尚未完全闡明。近年來隨著對哮喘研究的逐漸深入，人們認識到氣道上皮細胞及其屏障功能受損可能在哮喘發病機制中起著重要作用[1-2]。氣道上皮細胞之間的連接由緊密連接、黏附連接和縫隙連接共同組成，是氣道上皮屏障的主要組成部分，其中較為重要的是緊密連接[3]。閉鎖蛋白（occludin）是首先被發現的緊密連接相關蛋白，在細胞間緊密連接的形成中起著重要作用，但氣道上皮occludin的表達變化與哮喘發病的關系尚缺乏深入研究[4]。霧化吸入糖皮質激素是目前治療哮喘最有效的方法之一，而布地奈德是臨床上普遍應用的吸入型激素。本研究旨在觀察occludin在哮喘小鼠氣道上皮的表達及吸入布地奈德對其表達的影響，探討occludin在哮喘發病中的作用及吸入型糖皮質激素治療哮喘的機制。

1 材料與方法

1.1材料

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁干粉（Sigma公司），兔抗鼠occludin多克隆抗體（博奧森公司），HRP山羊抗兔二抗（康成生物公司），RNA提取試劑盒（Tiangen Biotech公司），引物合成（上海生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（R&D公司），2×Taq PCR Master Mix試劑盒，Rea Master Mix（SYBR GreenⅠ）熒光定量試劑盒（Tiangen公司），SP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1動物分組及哮喘模型的制備將24只雌性BALB/c小鼠用隨機數字表法分成哮喘組、布地奈德組及對照組，每組8只。哮喘組：0、7及14 d腹腔注射OVA+氫氧化鋁的生理鹽水混懸溶液0.2 ml（含OVA 20μg，氫氧化鋁2 mg）致敏，第21天起給予1%OVA霧化激發30 min，1次/d，連續14 d。每次激發前1 h霧化吸入生理鹽水2 ml。布地奈德組：致敏及激發同哮喘組，但每次激發前1 h霧化吸入布地奈德混懸液1 mg（2 ml）。對照組：用相同的方法以生理鹽水代替OVA進行致敏和激發。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液（BALF）嗜酸性粒細胞計數小鼠末次激發24 h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2 ml麻醉，剖開胸腔，結扎右側主支氣管，以1 ml生理鹽水灌洗左肺，每只小鼠重復灌洗3次，收集灌洗液離心，取細胞懸液涂片、染色，在光學顯微鏡下計數嗜酸性粒細胞（eosinophies，EOS）。

1.2.3支氣管肺組織HE與PAS染色取右上肺組織于4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度5μm。HE染色光鏡下觀察支氣管及其周圍組織的病理改變，PAS染色觀察氣道黏膜上皮層杯狀細胞增生和黏液分泌情況。氣道上皮杯狀細胞增生評分標準參照文獻[5]，在400倍光鏡下每只小鼠隨機選擇10個氣道，計數PAS染色陽性的杯狀細胞積分（無杯狀細胞為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分），所有杯狀細胞積分取平均值。

1.2.4電鏡觀察氣道上皮超微結構取右肺中葉切成1 mm×1 mm×1 mm大小置于裝有25%戊二醛的EP管中固定，磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，蒸餾水漂洗，脫水，1∶1的包埋液+丙酮常溫滲透，100%包埋液滲透，包埋，沉降，聚合，切片，厚度60 nm，行鏡檢。

1.2.5免疫組織化學方法檢測occludin的表達取右下肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，制備3μm石

蠟切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（SP）行免疫組織化學染色，操作步驟按試劑盒說明書進行，兔抗小鼠occludin多克隆抗體以1∶400稀釋。陽性染色為氣道上皮細胞表面和細胞間的包膜上黃色或棕黃色染色，說明有occludin表達，同時設置陰性對照。圖像用Motic Fluo 1.0軟件分析，在相同放大倍數（×400）下，每張切片隨機選6個氣道視野，測定其光密度（optical density，OD）值。1.2.6實時熒光定量PCR檢測肺組織occludin mRNA表達取右下肺組織，每份樣品取約50 mg，充分研磨，加入1ml Trizol提取總RNA并合成cDNA，再PCR擴增。Occludin引物序列5'-AAGAGTACAT GGCTGCTGCT-3'為上游引物，5'-TTTGCCTCTGGA GAGAATTG-3'為下游引物，此對引物擴增出230 bp片段。以β-actin為內參照，上游引物為5'-AATGG GTCAGAAGGACTCCT-3'，下游引物為5'-ACGGTTG GCCTTAGGGTTCAG-3'，此對引物擴增出250 bp片段。反應條件（95℃2 min，95℃5 s，55.7℃20 s，72℃15 s，共40個循環，在循環第2步采集熒光）。反應結束后記錄Ct值（基本循環數），算出ΔCt（基本循環與內參循環數差值）和ΔΔCt（最低樣本ΔCt值-其他各樣本ΔCt值），計算目的基因mRNA的相對表達量RQ值（occludin mRNA/β-actin mRNA即RQ值=2-ΔΔCt）。

1.3統計學方法

采用SPSS 11.5統計軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，每組樣本均數經過方差齊性檢驗后，單因素方差分析用于組間比較，SNK檢驗用于組間兩兩之間的比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1BALF中EOS計數

與對照組EOS計數（0.750±0.707）比較，哮喘組EOS計數（20.875±1.808）顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；布地奈德組EOS計數（10.625± 1.302）明顯低于哮喘組，但仍高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

2.2支氣管肺組織HE染色結果

哮喘組小鼠氣道上皮脫落不完整，氣道黏膜層有大量炎癥細胞浸潤，黏液腺增生，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，氣道壁及氣道平滑肌增厚，管腔狹窄，部分氣道管腔內可見黏液栓；布地奈德組病理改變較哮喘組減輕；對照組未見上述病理改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態學變化（HE×200）

2.3PAS染色結果

哮喘組小鼠氣道上皮PAS染色陽性的杯狀細胞胞漿染成紫紅色，細胞核為藍色，可見大量杯狀細胞增生，管腔內見大量染成紫紅色的黏液；布地奈德組杯狀細胞增生減少，管腔內見少量黏液；對照組未見明顯杯狀細胞增生和黏液分泌。與對照組杯狀細胞積分（0.250±0.463）比較，哮喘組氣道上皮PAS染色陽性的杯狀細胞積分（3.375±0.744）明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；布地奈德組杯狀細胞積分（1.625±0.518）明顯低于哮喘組，但仍高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.4電鏡觀察氣道上皮的超微結構

對照組小鼠氣道上皮纖毛完整，無脫落，微絨毛較多，結構清晰，上皮細胞間的連接結構完整，細胞緊密排列，基底膜完整；哮喘組氣道上皮纖毛明顯脫落、變稀、變短，微絨毛減少，細胞頂端呈泡狀膨大，

上皮細胞間的連接結構有松裂或缺失，細胞間隙增寬，基底膜不連續；布地奈德組上述表現較哮喘組減輕。見圖3。

圖2 各組小鼠肺組織PAS染色（PAS×200）

圖3 各組小鼠氣道上皮的超微結構（×12 000）

2.5免疫組織化學檢測氣道上皮occludin的表達

對照組小鼠氣道上皮occludin主要在氣道上皮細胞表面和細胞間的包膜上呈線性表達，陽性染色為黃色或棕黃色染色。布地奈德組小鼠氣道上皮occludin表達較對照組明顯減弱，但仍比哮喘組表達顯著，見圖4。哮喘組occludin的OD值（0.126± 0.032）低于對照組（0.652±0.313）及布地奈德組（0.337±0.028），差異均有統計學意義（P＜0.01）；與對照組比較，布地奈德組的OD值仍減小，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠氣道occludin的表達（SP法×400）

2.6肺組織occludin mRNA的表達

目的基因的融解曲線為單峰曲線，融解溫度均一，峰的形狀較尖銳（見圖5），表明無非特異性產物

及引物二聚體生成，引物特異性良好，退火溫適中。各樣品occludin mRNA的相對表達量（RQ值）見圖6，3組小鼠occludin mRNA的RQ值分別為（7.200± 4.959）、（3.127±2.030）和（4.772±1.848），組間比較差異無統計學意義（F=1.960，P＞0.05）。

圖5 目的基因的溶解曲線圖

圖6 各樣品occludin mRNA的RQ值

3 討論

氣道上皮屏障是支氣管肺組織抵御外界環境有害刺激的第一道屏障，由氣道上皮表面液和上皮細胞及上皮細胞間的連接構成，緊密連接作為細胞間連接的主要形式，位于氣道上皮細胞的頂端和細胞間的側膜上，是維持氣道上皮屏障功能正常的關鍵結構[6]。Occludin是第一個被發現的緊密連接相關蛋白，是緊密連結結構的主要功能調節蛋白，通過封閉細胞間隙，調節細胞旁滲透性[4]。氣道上皮細胞通過細胞間的連接結構阻擋環境中的變應原、粉塵、病毒等入侵，而這層結構的缺陷可導致各種環境激發因子和炎癥細胞更快速地通過氣道上皮屏障[7]。本實驗不僅觀察到哮喘小鼠氣道上皮有大量炎癥細胞浸潤，黏液腺增生，氣道壁及氣道平滑肌增厚，管腔狹窄等病理改變，而且通過電鏡觀察還發現哮喘小鼠氣道上皮細胞間的連接結構有松裂、缺失，細胞間隙增寬，基底膜不連續的現象。DE等[8]研究也發現，哮喘患者的支氣管活檢組織中氣道上皮緊密連接相關蛋白α連環素、ZO-1和E-鈣黏蛋白的表達較非哮喘患者明顯降低，氣道上皮間的緊密連接結構有缺失，哮喘患者氣道上皮屏障的缺失導致環境激發因子更加容易入侵和嗜酸性粒細胞在氣道上皮的浸潤。本實驗不僅發現哮喘小鼠氣道上皮緊密連接結構遭受破壞，還觀察到哮喘組小鼠氣道上皮細胞occludin蛋白表達較正常對照組明顯減弱，但occludin mRNA表達在3組小鼠之間的差異無統計學意義。XIAO等[9]在哮喘患者氣道上皮細胞occludin表達的研究中也得到同樣的結果。這也許是occludin在哮喘小鼠或哮喘患者氣道上皮表達的減少與蛋白的翻譯有關，而與蛋白的轉錄無關。本研究結果提示，氣道上皮屏障結構的破壞與occludin表達的降低可能是哮喘發病的病理基礎之一。

布地奈德是目前臨床上普遍用于治療哮喘的吸入型糖皮質激素，能減輕氣道炎癥，有效治療哮喘[10]。既往的研究表明，吸入糖皮質激素主要通過抑制EOS等炎癥細胞在氣道的募集和活性，抑制炎癥介質的生成和釋放，增強氣道平滑肌細胞β2腎上腺素受體的反應性等機制發揮抗炎作用[11-12]。本研究結果也顯示，霧化吸入布地奈德能抑制哮喘小鼠氣道上皮EOS浸潤、抑制杯狀細胞增生和黏液腺分泌，減輕氣道黏膜充血水腫等炎癥反應。但糖皮質激素對哮喘氣道上皮細胞間的連接結構及occludin的表達有何影響，至今尚不清楚。SEKIYAMA等[13]的研究觀察地塞米松對體外培養的人氣道上皮細胞屏障功能的影響，結果發現地塞米松能促進氣道上皮細胞間緊密連接的形成，降低上皮細胞的通透性，改善氣道上皮的屏障功能。本實驗顯示，霧化吸入布地奈德后，氣道上皮細胞occludin的表達較哮喘組增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。電鏡下觀察到布地奈德組小鼠氣道上皮細胞間緊密連接結構的破壞也較哮喘組減輕。提示布地奈德能上調哮喘小鼠氣道上皮occludin的表達，促進氣道上皮細胞間連接結構的修復，這也許是布地奈德治療哮喘的另一藥理機制。

綜上所述，本研究結果表明，哮喘小鼠氣道上皮屏障結構的不完整和occludin表達的降低，可能是哮喘發病和病情進展的機制之一，而布地奈德能上調氣道上皮occludin的表達和促進受損氣道上皮的修

復，該研究結果為臨床上霧化吸入布地奈德治療哮喘提供了新的理論依據。

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（張蕾 編輯）

Effect of Budesonide on expression of occludin in airway epithelium of asthmatic mice*

Man-qing YOU1,Jun DENG2,Yu-jia LIANG2,Ying XIONG2, Bin XIONG2,Song-ping WANG2
(1.Department of Respiratory Diseases,the People's Hospital of Leshan,Leshan,Sichuan 614000,P.R.China;2.Department of Respiratory Diseases,the Affiliated Hospital, Luzhou Medical College,Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

【Objective】To observe the expression of occludin in airway epithelium of asthmatic mice and effect of Budesonide on its expression.【Methods】Totally 24 female BALB/c mice were randomly divided into asthma group,Budesonide group and control group with 8 mice in each group.Asthmatic mouse model was established by intraperitoneal injection and atomized inhalation of ovalbumin.Mice in the Budesonide group were treated with aerosolized Budesonide 1 mg each time 1 h before ovalbumin provocation for 14 consecutive days.Eosinophils(EOS)in BALF were counted.HE and PAS staining was used to observe the pathological

Budesonide;asthma;airway epithelium;tight junction;occludin

R562.25；R-332

A

1005-8982（2015）27-0008-06

2014-12-03

四川省衛生廳科研項目（No：110341）

王宋平，E-mail：wang4816@sina.com；Tel：0830-3165321

changes,goblet cell proliferation and mucus secretion in bronchial and lung tissues.The ultrastructure of airway epithelium was observed by electron microscope.The expression of occludin in airway epithelium was measured with immunohistochemical method and real-time PCR.【Results】Compared with the normal control group,the asthma group showed significant increases of EOS,goblet cells and mucus secretion,and a decrease of occludin protein expression in bronchial and lung tissues(P＜0.01).However,the Budesonide group showed fewer EOS and goblet cells,less mucus secretion and higher expression of occludin protein in bronchial and lung tissues as compared with the asthma group(P＜0.01).Electron microscope showed incomplete intercellular junction between airway epithelial cells in the asthma group,but Budesonide alleviated the above changes.【Conclusions】Budesonide could up-regulate the expression of occludin in airway epithelium of asthmatic mice,promote repair of damaged airway epithelial barrier,which might be a new mechanism of inhaled corticosteroids for treating asthma.