熱應激預處理對創傷性休克大鼠早期腦組織中一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶的表達與腦損傷的影響

馬軼杰，崔薇，李建華，馬獻昆，于立，蔡云鵬，王幫奎

(新疆生產建設兵團醫院1.神經外科，2.干部保健科，新疆 烏魯木齊 830000）

·論著·

熱應激預處理對創傷性休克大鼠早期腦組織中一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶的表達與腦損傷的影響

馬軼杰1，崔薇2，李建華1，馬獻昆1，于立1，蔡云鵬1，王幫奎1

(新疆生產建設兵團醫院1.神經外科，2.干部保健科，新疆 烏魯木齊 830000）

目的研究熱應激預處理對創傷性休克早期大鼠腦組織一氧化氮（NO）濃度、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達量與腦組織病理改變的影響。方法96只SPF級雄性SD大鼠隨機均分為未處理組和處理組，每組又分別設未休克組、休克后0 h、1 h、2 h、3 h及4 h組6個亞組，熱應激預處理后建立創傷性休克模型，留取腦組織，觀察腦組織病理學和檢測腦組織NO濃度、iNOS mRNA表達量的變化。結果病理觀察可見處理組各時間點腦病理損傷較未處理組病理損傷輕；NO濃度處理組均低于同時間點未處理組，休克后0 h時均有升高（P＜0.05），休克后1 h時腦組織NO濃度均有明顯降低（P＜0.05）；iNOS mRNA表達量處理組均低于同時間點未處理組，未處理組在休克后3 h出現一個峰值（3.50±0.150）u/mg·prot。結論熱應激預處理能明顯降低創傷性休克大鼠早期腦組織中NO、iNOS的表達,減輕創傷性休克早期大鼠腦損傷。

熱應激；創傷性休克；腦；損傷

創傷性休克是由于機體遭受暴力作用后，造成重要臟器損傷、嚴重出血等情況，使患者有效循環血量銳減，微循環灌注不足，以及創傷后的劇烈疼痛、恐懼等多種因素綜合形成的機體代償失調的綜合征。研究表明，50%的戰傷死亡是急性失血所致，約1/3的創傷患者死于入院前失血性休克，發生在創傷后2 h內的致死率為20%[1]，其中腦是最早出現損傷的器官之一。熱應激是指機體在高環境溫度中做出的一系列非特異性全身應答反應。研究表明，熱應激預處理可激活機體內在的保護性機制減輕創傷性腦損傷對機體的損害[2]，但熱應激對創傷性休克后繼發性腦損傷的影響尚未見文獻報道，為觀察熱應激對創傷性休克大鼠繼發性腦損傷的影響，本實驗通過高溫預處理后建立創傷性休克模型，探討熱應激預處理對創傷性休克大鼠早期腦組織中一氧化氮（NO）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達及對腦損傷的影響，并對其變化規律進行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組

實驗使用SPF級SD雄性大鼠（n=96，年齡8～10周，體重280～320 g）從新疆疾控中心購得。自購入后適應實驗室環境1周，飼養環境保持：溫度（22± 1）℃，相對濕度（50±5）%，大鼠由無菌飼料喂養，自由攝食和飲水。實驗大鼠隨機分成兩組：處理組和未處理組，每組又分別設未休克組、休克后0、1、2、3 h及4 h組6個亞組，每組8只。

1.2主要實驗器材及環境

BL-420F生物機能監測系統（成都泰盟公司），BI-2000電子計算機圖像分析儀（成都泰盟公司），酶標儀、熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司），CS1O1-2D型電熱鼓風干燥箱(重慶四達實驗儀器廠），NO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），iNOS引物（上海生物工程有限公司合成），正向引物：5'-GAAAGC GGTGTTCTTTGCTTCT-3'，反向引物：5'-CTTATCTG TTCCATGCAGACAACCT-3'；β-actin正向引物：5'-AACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向引物：5'-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3'。

1.3實驗方法

1.3.1模型制作實驗前大鼠常規禁食、禁水6 h。處理組大鼠置于鐵籠中放入電熱鼓風干燥箱內使其肛溫緩慢達到42℃并維持15 min，參照孫英剛等[3]建立的創傷失血性休克模型，3%戊巴比妥腹腔麻醉，使用靜脈留置針行右頸動、靜脈和右股動脈插管，右頸動脈插管接生物機能監測系統測量血壓等血流動力學指標，頸靜脈插管建立簡易補液通道，右股動脈插管以備放血。大鼠穩定10 min后，利用2 500 g鐵輪于30 cm高度擊中大鼠左下肢股骨中上段造成粉碎性骨折，致傷后簡易包扎傷口；經右股動脈放血使平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）維持在（35± 5）mmHg，若經打擊后血壓不能維持則通過補液通道輸注生理鹽水以維持MAP。模型完成時間控制在15～20 min，并以大鼠MAP達到（35±5）mmHg為休克0 h時間點。未處理組除不進行熱應激處理外，其方法同處理組，兩組中未休克組除不致傷外其余步驟同各實驗組。

1.3.2腦組織取樣按休克后5個時間點處理各組大鼠，達到休克維持時間點后馬上切取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，其余腦組織置于-80℃凍存，兩組中未休克組在插管完成后即進行取樣。

1.4觀測指標及方法

1.4.1腦組織NO測量稱取0.1g腦組織，在4℃生理鹽水中漂洗、拭干，于玻璃勻漿管中手工勻漿，用1 ml生理鹽水沖洗轉移至1.5 ml EP管內制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，測定光密度（optical density，OD）值，計算各樣本濃度。

1.4.2腦組織iNOS mRNA表達量提取腦組織總RNA并測量濃度，計算20μl反轉錄體系所需體積，然后進行反轉錄得到cDNA，最后以反轉錄出來的cDNA為模板配成20μl體系，設定擴增參數：95℃預變性3 min；95℃預變性10 s，60℃復性30 s，75℃延伸10 s，共41個循環；最后于75℃延伸10 min，得出iNOS和內參β-actin的Ct值。

1.4.3病理學變化包埋好的腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察組織病理變化。

1.5統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1腦組織NO濃度

未處理組和處理組休克后各時間點腦組織NO

濃度均高于未休克組（P＜0.05）；處理組在休克后腦組織NO濃度均低于未處理組；未處理組和處理組在休克后0 h時腦組織NO濃度有顯著升高（P＜0.05），在休克后1 h時腦組織NO濃度均有明顯降低（P＜0.05），隨時間推移腦組織中NO濃度都逐漸升高，但未處理組升高更明顯（見圖1）。

圖1 腦組織NO濃度比較

2.2腦組織iNOS mRNA表達量

未處理組和處理組在休克后各時間點均高于未休克組（P＜0.05），處理組休克后均低于未處理組，未處理組在休克后3 h出現一個峰值（3.50±0.150）u/mg·prot，而處理組則未出現；未處理組休克后各時間點較前一時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05），而處理組差異則不明顯（見圖2）。

圖2 腦組織iNOS mRNA表達量比較

2.3病理學變化

顯微鏡下發現處理組未休克組，休克后0h組和1h組腦實質無水腫，神經細胞無變化；休克后2 h組腦組織實質輕度水腫，休克后3 h組和4 h組腦組織實質輕度水腫，膠質細胞輕度增生。未處理組在休克后0 h即出現腦組織實質輕度水腫，休克后1 h腦組織腫脹，部分神經細胞核消失，隨時間推移腦組織變化明顯；處理組各時間點病理變化較未處理組輕（見圖3）。

圖3 腦組織切片（HE×200）

3 討論

熱應激是機體暴露在熱環境中產生的一系列非特異性全身反應，多種細胞因子在熱應激發生發展的病理過程起重要作用。創傷性休克會導致有效血容量明顯減少、血流灌流不足、微循環障礙，若無法及時得到有效救治，2 h內的致死率為20%[1]，其中腦是最早出現損傷的器官之一。以往研究證實熱應激可以提高機體對于有害刺激的耐受力，但對熱應激早期影響的報道較少，本實驗在經典熱應激大鼠模型基礎上造成創傷性休克，觀察早期腦損傷的特點。

本實驗發現，處理組腦病理損傷較未處理組輕，未處理組可見腦組織腫脹，部分神經細胞核消失，隨時間推移腦組織變化明顯。創傷性休克大鼠致傷前給予熱應激處理減輕腦損傷的程度，這可能是由于熱應激預處理誘導熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）表達增加，HSP是一組非特異性細胞保護蛋白，有多種功能，因應激誘導機體表達熱休克蛋白增加機體細胞耐受不利因素的作用，減輕不利因素對機體細胞的損傷[4]，可見熱應激預處理的保護作用是體現在多方面的，包括減輕腦組織的出血、水腫和炎癥細胞浸潤。

NO是機體內重要的信使分子和效應分子且具有多種生理功能，NO產生過量可激發氧化應激加

重組織損傷[5]，目前不少研究發現，各種傷害刺激包括生物、物理及化學等因素可誘發動物腦內各區NO顯著升高[6-7]。本研究發現，未處理組與處理組NO濃度比較存在顯著差異，兩組在休克后各時間點均高于未休克組，未處理組休克后均高于處理組；另外未處理組與處理組iNOS mRNA表達量同時間點比較存在差異，且各時間點均高于未休克組，未處理組均低于同時間點處理組，未處理組在休克后3 h出現一個峰值（3.50±0.15）u/mg·prot，而處理組則未出現，未處理組休克后各時間點較前一時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05），而處理組差異則不明顯。有研究[8]表明，由iNOS激活產生的NO呈現神經毒性作用，損傷腦血管內皮的完整性，使其通透性增加導致腦水腫。由此可見，未處理組隨著休克時間的延長，可能是由于創傷性休克進而激發iNOS表達量增加，NO大量產生，進而生成強毒性的氧自由基造成腦的廣泛性損傷，而處理組由于熱應激作用使大鼠機體增加對休克的耐受能力，或者是熱應激抑制iNOS/NO途徑，從而與未處理組比較iNOS的表達明顯降低。

另外，未處理組與處理組NO濃度在休克后0 h時均有顯著升高，應考慮是在建立創傷性休克模型過程中，由于有效循環血量銳減、劇烈疼痛等多種因素導致大鼠為維持正常生理狀態產生過多NO所引起；未處理組與處理組NO濃度在休克后1 h時均有顯著降低，以往有學者研究[9]表明，在應激和一些疾病條件下，NO的合成明顯升高，似乎與以往的研究結果矛盾，但以往研究多為NO在應激、創傷或疾病幾天后的變化，最早也是在4～6 h。休克后NO濃度下降的原因可能是由于熱應激或者創傷休克時，由于機體大量出汗或血容量的減少造成NO丟失[10]；熱應激使機體產生大量的熱休克蛋白[11]，HSP可以在轉錄水平上抑制iNOS的表達，而細胞因子對NO合成的促進作用恰是通過高水平的iNOS mRNA來實現的，因此在應激早期，HSP對NO生成起到一種抑制作用，而且處理組較未處理組降低得更顯著，說明熱應激預處理誘導機體合成更多的HSP。

綜上所述，熱應激預處理能明顯降低創傷性休克大鼠早期腦組織中NO、iNOS的表達，對創傷性休克大鼠腦損傷有明顯的保護作用，為創傷性休克提供一種早期預防和救治措施。

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（張蕾 編輯）

Changes of NO and iNOS expression in brain tissue and injury of brain in traumatic shock rats preconditioned with heat stress

Yi-jie MA1,Wei CUI2,Jian-hua LI1,Xian-kun MA1,Li YU1, Yun-peng CAI1,Bang-kui WANG1
(1.Department of Neurological Surgery,2.Department of Geriatrics,Bingtuan Hospital of Production and Construction of Xinjiang,Urumqi,Xinjiang 830000,P.R.China)

【Objective】To research nitric oxide(NO)concentration,induced nitric oxide synthase(iNOS) mRNA expression and the pathological changes of brain tissue in traumatic shock rats preconditioned with heat stress.【Methods】A total of 96 male SD rats were randomly divided into untreated group and treatment group with equal number,and each group was equally divided into 6 subgroups:no shock group and shock 0 h group,1 h group,2 h group,3 h group and 4 h group.The model of traumatic shock was established after heat stress pretreatment and the brain tissue was taken for observation of pathological changes and detection of NO and iNOS mRNA expression in brain tissue.【Results】The lesions of brain tissue structure were lighter in the treatment group than those of the untreated group at the corresponding time point.The NO concentration of the treatment group was lower than that of the untreated group at the corresponding time point,both groups had a rise at shock 0 h(P＜0.05)and a reduce at shock 1 h(P＜0.05).INOS mRNA expression of the treatment group was lower than that of the untreated group at the corresponding time point, there was a peak value[(3.50±0.150）U/mg·prot]in the untreated group in 3 h.【Conclusion】Heat stress pretreatment can significantly reduce NO concentration and iNOS mRNA expression in brain tissue and alleviate the brain injury of rats in early stage of traumatic shock.

heat stress;traumatic shock;brain;injury

R641；R-332

A

1005-8982（2015）27-0014-04

2015-03-17

李建華，E-mail：lijh_2008@126.com