高遷移率族蛋白AT-hook2在非小細胞肺癌患者血清中的表達及與預后的關系

杜江，張林

（中國醫科大學附屬第一醫院胸外科，遼寧 沈陽 110001）

·臨床論著·

高遷移率族蛋白AT-hook2在非小細胞肺癌患者血清中的表達及與預后的關系

杜江，張林

（中國醫科大學附屬第一醫院胸外科，遼寧 沈陽 110001）

目的探討非小細胞肺癌患者血清中不同時間高遷移率族蛋白AT-hook2（HMGA2）的表達情況，分析其與預后間的關系。方法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測術前、術后一周及術后一個月52例非小細胞肺癌（NSCLC）患者血清中HMGA2的表達情況。結果術前及術后一個月HMGA2在NSCLC患者血清中的表達均顯著高于對照組（t=2.541，t=2.384，P＜0.05）。術后一周HMGA2的表達水平較術前有顯著降低（t= 2.334，P＜0.05）而與對照組差異不大（t=1.138，P＞0.05）。術前及術后一個月HMGA2在血清中的表達水平與淋巴結轉移和TNM分期有關。術前和術后一個月HMGA2在血清中陽性表達者無病生存率（DFS）降低，而術后一個月HMGA2血清表達水平是獨立的預后影響因素（HR=2.31，95%CI：1.21～4.98，P＜0.01)。結論ELISA法檢測HMGA2在患者血清中的水平可以用來作為判斷預后的指標，指導治療。

高遷移率蛋白AT-hook2；轉移；酶聯免疫吸附試驗；無病生存率

轉移和復發一直是肺癌診斷治療上的難點，目前還缺少敏感度較高的臨床檢測指標。高遷移率族蛋白AT-hook2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是一種癌基因，在肺癌細胞及組織中高表達，其表達與腫瘤的侵襲轉移密切相關[1]，其表達含量有可能成為預測肺癌復發和轉移情況的指標。本實驗應用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked im munosorbnent assay，ELISA）檢測方法，測定非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者在不同時期血清中HMGA2的表達水平，研究其與患者預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象

實驗組選取2010年6～9月在中國醫科大學附屬第一醫院胸外科接受手術治療并且由術前或術后病理證實為非小細胞肺癌的患者52例。其中男33例，女19例，年齡39～77歲，中位年齡57歲。所有患者術前均未行抗腫瘤治療。具體臨床病理資料見表1。對照組為16例體檢健康者，男8例，女8例，年齡33～65歲，中位年齡44歲。52例患者均獲得隨訪，隨訪時間6～38個月，中位隨訪時間22個月。

表1 患者基本臨床病理參數（n=52）

告知患者取得的所有標本的目的與用途，可能的風險和后果，并獲得患者的簽字同意，取得醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2主要試劑和儀器

HMGA2夾心法ELISA試劑盒（美國USCN公司），96孔酶標板（美國Corning公司），低溫冷凍冰箱（德國Simens公司），高速離心機（日本Hitachi公司），酶標儀（美國Bio-Rad公司），自動洗板機（日本EKA公司）。

1.3血漿制備

分別于術前、術后1周及術后1個月（化療前），晨空腹常規靜脈采血2 ml，肝素抗凝，4℃，2 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80℃冰箱冷凍備用。對照組體檢時同法提取。術前、術后1周及術后1月復查時均獲得全部52例標本。

1.4酶聯免疫吸附試驗

嚴格按照HMGA2 ELISA Kit試劑盒所示步驟進行實驗。發光顯色后，酶標儀在450 nm測定光密度（optical density，OD）值，取570 nm OD值為校正波長。以標準品濃度為橫坐標，相應的OD值為縱坐標繪制標準曲線，由此計算各待測樣本的濃度。為便于生存分析，設定1.1 ng/ml為HMGA2表達的定性cut-off值，＞1.1ng/ml為陽性，＜1.1 ng/ml為陰性。

1.5隨訪方法

52位NSCLC患者，隨訪時間6～38個月，中位隨訪時間22個月，隨訪以復發時間為觀察終止時間，主要根據CT、PET-CT等影像學檢查結果判定是否復發。隨訪期間32例出現腫瘤復發，總體復發率61.5%。

1.6統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩樣本均數比較及

配對樣本均數比較用t檢驗，多樣本均數比較用One-Way ANOVA檢驗。單因素生存率比較用Log-rank檢驗，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。多因素分析用Cox比例回歸風險模型，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1HMGA2在非小細胞肺癌患者血清中的變化

術前及術后1個月HMGA2在NSCLC患者血清中的表達均顯著高于對照組（t=2.541，t=2.384，P＜0.05）。術后1周HMGA2的表達水平較術前有顯著降低（t=2.334，P＜0.05）而與對照組差異不大（t= 1.138，P＞0.05），術后1個月較術后1周HMGA2表達水平有一定提高，但差異無統計學意義（t=1.375，P＞0.05）。見表2。

表2 NSCLC患者不同時期以及對照組HMGA2血清中表達情況（ng/ml±s）

表2 NSCLC患者不同時期以及對照組HMGA2血清中表達情況（ng/ml±s）

組別例數HMGA2濃度水平對照組160.73±0.37術前521.45±0.51術后1周520.98±0.25術后1個月521.17±0.44

表3 NSCLC患者外周血中HMGA2不同時期濃度與臨床病理特征的關系

2.2NSCLC患者血清中HMGA2濃度與臨床病理因素間的關系

術前HMGA2血清中濃度與年齡、性別、吸煙史、病理分型、分化程度和T分期無關，而與有淋巴結轉移和較晚的TNM分期相關（t=4.783，t=3.112，P＜0.05）。術后1周復查HMGA2濃度則與所有納入的臨床病理因素無關（P＞0.05），特別是對有淋巴結

轉移和TNM分期較晚的患者濃度值較術前有顯著降低（t=0.759，t=0.574，P＞0.05）。而術后1個月復查淋巴結轉移者和晚期NSCLC患者HMGA2在外周血中的表達重新出現相關性（t=3.795，t=3.227，P＜0.05）。見表3。

2.3NSCLC患者HMGA2在血清中的表達與無病生存率之間的關系

52例NSCLC患者，隨訪時間6～38個月，中位隨訪時間22個月，隨訪期間有32例復發，總體復發率61.5%。Kaplan-Meier法繪制無病生存率（disease-free survival，DFS）生存曲線，顯示術前及術后1個月HMGA2血清表達陰性者較表達陽性者38個月DFS明顯要高（χ2=6.45，χ2=8.24，P＜0.05）；而術后1周HMGA2血清表達陽性和陰性DFS無區別（χ2=0.059，P＞0.05），見附圖。Log-rank單因素差異性檢驗結果顯示術前HMGA2血清中濃度，術后1個月HMGA2血清中濃度，病理分期，淋巴結轉移有DFS差異。進一步采用Cox模型多因素生存分析，結果顯示術后1個月HMGA2血清中濃度（HR=2. 31，95%CI:1.21～4.98，P＜0.01）、病理分期、淋巴結轉移為獨立的DFS影響因素。而其他變量包括年齡、性別、吸煙史、病理類型、病理分級、T分期不是獨立的DFS影響因素。

附圖 HMGA2陽性表達與陰性表達患者的無病生存率Kaplan-Meier曲線

3 討論

高遷移率族蛋白AT-hook2是高遷移率蛋白（HMG）家族中的一員，首先在發育期的間質組織中被發現，而在成熟的細胞中很少表達[2]。它在多種細胞過程中承擔重要生物學作用，如基因調控，細胞周期，細胞分化以及病毒整合特別是上皮間質轉化過程等[2-4]。目前，已經有大量的研究表明HMGA2是一種癌基因，在多種癌細胞及組織中被檢出，并且發現其表達與腫瘤的侵襲轉移密切相關[5-10]。在腫瘤發生過程中，它被miRNA-let7及miR154等miRNA負向調控[11-12]，同時也作為ceRNA（競爭性內源性RNA）負作用于miRNA[13]。該發現表明HMGA2似乎是腫瘤發生、發展的重要基因節點，其表達含量有可能成為預測肺癌發展水平的指標。

癌基因蛋白在患者外周血中的表達往往是腫瘤細胞代謝，分泌或壞死的產物。已經有人通過在乳腺癌外周血中檢測HMGA2的mRNA表達水平來評價其與預后的相關性。并且發現其表達與乳腺癌的分期，轉移和預后明顯相關[14]。在本實驗中，筆者使用HMGA2-ELISA試劑盒檢測不同時期外周血中HMGA2的表達水平[15]，結果顯示52例NSCLC患者術前及術后1個月外周血中HMGA2的平均表達水平高于16例健康人對照組的平均表達水平（P＜0.05）。但術后1周的NSCLC患者HMGA2的表達水平較術前顯著降低（P＜0.05），而與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。結果說明，在NSCLC患者血清中的HMGA2是高表達的，而手術切除腫瘤使得外周血中HMGA2表達水平有顯著的降低。術后1個月HMGA2的平均表達水平與術后1周的表達水平差異無統計學意義，而與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。表明術后1個月HMGA2血清表達水平有所恢復。

對不同時期HMGA2血清中表達水平與臨床病理因素之間的關系進行分析，發現術前HMGA2血清中表達水平與年齡、性別、吸煙史、病理分型、病理分級、T分期無關，而與淋巴結轉移和TNM分期相關

（P＜0.05）。術后1周血清中HMGA2表達水平與所有臨床病理因素無關。術后1個月血清中HMGA2表達水平與淋巴結轉移和TNM分期相關。表明HMGA2在NSCLC患者血清中的表達與腫瘤轉移和較晚的TNM分期相關，提示HMGA2參與NSCLC的復發和轉移。手術可能降低HMGA2的血清表達水平，在部分患者中控制腫瘤的復發和轉移。

全部52例患者均獲得隨訪，隨訪截止于2013年11月。隨訪期間共32例復發，總體復發率61.5%。為驗證血清HMGA2表達與腫瘤復發情況之間的關系，根據對照組表達上限設定HMGA2濃度的cutoff值，并繪制血清HMGA2表達情況與無病生存率的Kaplan-Meier曲線。結果顯示，術前和術后1個月的血清HMGA2陽性表達與較低的DFS相關，而術后1周的表達水平則與DFS無關。對各臨床因素做Log-rank檢驗，術前血清HMGA2水平，術后1個月血清HMGA2水平，淋巴結轉移和TNM分期對DFS的影響存在差異（P＜0.05）。再將這些因素納入到Cox模型多因素生存分析，結果表明術后1個月血清HMGA2表達水平是獨立的預后風險因素，表達陽性意味著術后復發和轉移的可能性增大。該結果與相關實驗在乳腺癌血清中mRNA的表達結果一致[15]。證明HMGA2應當與NSCLC的轉移和復發相關，并影響到患者的預后無病生存率。

雖然應用RT-PCR法檢驗外周血中的mRNA含量進行HMGA2的檢測可能更精確，敏感性更強，但是高昂的價格阻礙它在臨床上的實際應用[15-16]。本實驗應用相對廉價的ELISA特異性試劑盒進行HMGA2血清濃度的檢測，方法成熟，操作簡單，并且實驗結果證明此法檢測出的HMGA2表達水平能夠對患者術后是否復發和轉移進行預測和判斷。進行多時段的HMGA2血清學檢測可以作為觀察NSCLC術后病情變化的重要指標。

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（張蕾 編輯）

Expression of HMGA2 in peripheral blood and its correlation with prognosis of non-small cell lung cancer

Jiang DU,Lin ZHANG
(Department of Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of HMGA2 in non-small cell lung cancer(NSCLC) at different timing and its correlation with prognosis.【Methods】ELISA was performed to detect the expression of HMGA2 in the peripheral blood of 52 NSCLC before operation,one week after operation and onemonth after operation.The Kaplan-Meier curve and the Cox proportional hazards model were used to evaluate the prognostic role of each studied parameter.【Results】The expression of HMGA2 in NSCLC peripheral blood before operation and one month after operation was higher than that in the healthy controls(t=2.541 and 2.384 respectively,P＜0.05).The expression of HMGA2 one week after operation was significantly lower than that before operation(t=2.334,P＜0.05)and of no difference from that of the controls(t=1.138,P＞0.05).The expression level of HMGA2 was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM staging before operation(t=4.783 and 3.112,P＜0.05)and one month after operation(t=3.795 and 3.227,P＜0.05).There was no significant correlation with age,sex,T stage,histological type or differentiation grade(P＞0.05).Univariate analysis showed that the disease-free survival rate of the patients with negative HMGA2 expression was significantly higher than that of the patients with positive HMGA2 expression before operation and one month after operation(χ2=6.45 and 8.24 respectively,P＜0.05).Multivariate Cox regression analysis showed that high expression of HMGA2 one month after operation was a significant prognostic factor of low disease-free survival(HR=2.31,95%CI:1.21～4.98,P＜0.01).【Conclusion】The expression of HMGA2 in

HMGA2;metastasis;ELISA;disease-free survival

R734.2

A

1005-8982（2015）27-0027-05

2015-04-02

張林，E-mail：zhanglin_cmu@126.com，Tel：024-83283488

peripheral blood detected by ELISA could be considered as an important index for predicting prognosis of NSCLC.