液相色譜串聯質譜法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物

黃華發，張建平，黃朝章，謝衛，鄧其馨，吳清輝，劉秀彩，葉仲力，劉澤春

福建中煙工業有限責任公司技術中心，廈門集美濱水路298號361021

液相色譜串聯質譜法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物

黃華發，張建平，黃朝章，謝衛，鄧其馨，吳清輝，劉秀彩，葉仲力，劉澤春

福建中煙工業有限責任公司技術中心，廈門集美濱水路298號361021

建立了液相色譜串聯質譜測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物的方法。樣品用甲醇做萃取劑，經渦旋振蕩，C8液相色譜柱分離，串聯質譜儀MRM模式檢測。結果發現，在0.05～l0mg/L范圍內線性良好，定量限分別為2.5 μg/L、2.8 μg/L，回收率分別為95.2%、92.3%，相對標準偏差<5%。該方法操作簡單、效率高、適合推廣運用。

液相色譜質譜串聯法；再造煙葉；甲基異噻唑啉酮；甲基氯異噻唑啉酮

甲基異噻唑啉酮及其氯代物，俗稱卡松，活性成分為5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(甲基氯異噻唑啉酮，CMI)、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(甲基異噻唑啉酮，MI)，結構示意圖如圖1所示。廣泛用于化妝品、個人護理品、涂料等行業，作為防腐殺菌劑，保護產品免受微生物污染，延長產品壽命[1-2]。

圖l 2種異噻唑啉酮類防腐劑的結構示意圖Fig.1 Structural representation for MI and CMI

但是，暴露在甲基異噻唑啉酮類的環境中會存在健康隱患。研究發現甲基異噻唑啉酮類具有一定的細胞毒性和神經毒性，與皮膚接觸會產生過敏反應，吸入、不慎吞咽對人體有害[3-5]。我國《化妝品衛生規范》（2007年版）中規定甲基異噻唑啉酮在化妝品中最大允許使用濃度為0.01%[6]。

再造煙葉在使用的過程中為了防止霉變，減少損失，也可能在其中加入了甲基異噻唑啉酮及其氯代物，而在卷煙燃燒過程中進入人體，對人體產生危害。因此，對再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮類的含量進行測定和限定是十分必要的。

目前，對甲基異噻唑啉酮類的檢測方法主要有分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜質譜聯用法[9]、液相色譜[10-14]]和液相色譜質譜聯用法[15]。其中，液相色譜質譜串聯法更適用于高沸點或熱穩定性差等物質的分離檢測，同時隨著色譜技術的不斷發展，儀器普及率也較高，樣品預處理也相對簡單。因此，本文采用甲醇做萃取劑，經渦旋振蕩，C8液相色譜柱分離，串聯質譜儀MRM模式檢測，外標法定量的方式，建立適用于再造煙葉中甲基異噻唑啉酮及其氯代物的定量分析檢測方法，為卷煙安全性評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗所用再造煙葉樣品分別由福建金閩、廣東金科、云南瑞升公司提供，按YC/T 31制備樣品并測定水分。

5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮標準品（純度>98.2%，Dr Ehrenstorfer GmbH），2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮標準品（純度>99.5%，Dr Ehrenstorfer GmbH），避光貯存于0℃～4℃條件下；色譜純丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲醇；分析純無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉；N-丙基乙二胺鍵合固相（PSA）吸附劑、碳18（C18E）吸附劑、石墨化炭黑（GCB）吸附劑（均購自美國Supelco公司）；水（符合GB/T6682中一級水的規定）。

Agilent1290高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB5500三重四級桿質譜儀( 美國 Applied Biosystems SCIEX公司， 配備電噴霧離子源（ESI）)；VX-200漩渦混合振蕩儀（美國Labnet公司）；Sigma1-14高速離心機（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；AG104型電子天平（感量：0.0001 g，瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.2 儀器條件

LC條 件：進樣量：5μL；色譜柱：Agilent ZORBAX 300SB-C8（規格為 2.1×100 mm,1.8 μm）；流動相：A：甲醇，B：水；梯度洗脫程序：0～4min甲醇：水=2:8，4～6min甲醇：水=9:1，6～8min甲醇：水=2:8，流速：250 μL/min，柱溫：40℃。

MS/MS條件：電噴霧正離子掃描(ESI(+))；電壓為4 000 V；碰撞氣為高純氮氣，碰撞氣壓力為0.20 Pa(1.5 mTorr)；鞘氣為氮氣，壓力為6.00kPa(45 Torr)；毛細管溫度為350 ℃；監測模式為多級反應監控(multiple reaction monitoring,MRM)模式，質譜采集參數見表1。

表1 質譜采集參數Tab.1 MS/MS acquisition parameters

1.3 標準曲線

分別準確稱取10 mg(精確至0.1 mg)甲基異噻唑啉酮及其氯代物標準品于100 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液；準確移取不同體積的標準儲備液，以甲醇稀釋，得到質量濃度均為0.05、0.l0、0.50、1、5、l0 mg/L的系列混合標準溶液。

1.4 試樣處理

稱取約2 g樣品于50 mL具蓋離心管中，精確至0.1 mg，加入10 mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤，靜置10 min。

移取10 mL甲醇到離心管中，并置于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min速率振蕩2 min。

在離心管中分別加入4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，立即于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min速度振蕩2 min，以防止無水硫酸鎂遇水反應造成局部過熱并結塊，然后以4000 r/min離心5 min。

移取1.5 mL樣品提取液上層清液于2 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂、50 mgN-丙基乙二胺鍵合固相（PSA）吸附劑，于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min 速率振蕩2 min，以4000 r/min 離心5 min，收集上清液，待檢測分析。

2 結果與討論

2.1 質譜條件

MI和CMI的結構中均有含氮基團，有利于結合質子得到正離子，因此選擇正離子模式進行檢測。將質量濃度為5.0 mg/L的MI和CMI標準品通過注射泵引入離子源，在不加碰撞氣壓力的情況下進行一級質譜分析(Qt掃描)，結果表明這2種化合物的最強峰均為其準分子離子峰，因此選擇準分子離子[M+H]+為母離子，通過優化噴霧電壓、離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、輔助氣壓力、透鏡補償電壓等參數使得母離子強度最大。之后選擇碰撞氣壓力0.20 Pa，分別對分子離子進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到碎片的離子信息，找到強度較大的3個子離子，優化其碰撞能量，其中強度最大的一個子離子用作定量離子，另外兩個用作定性離子，得到的特征子離子和碰撞能量信息如表1所示。

2.2 液相色譜條件的選擇

C-18和C-8硅烷色譜柱是高效液相色譜（HPLC）中最常使用的色譜柱。MI和CMI極性大，采用正相極性柱需要很長的分離時間，由于本方法采用三重四級桿質譜MRM模式進行檢測，對色譜分離的要求較低，同時為了縮短檢測周期，因此最終采用反相非極性C8色譜柱為固定相。

分別選擇不同配比水相、有機相進行比較，選用不同比例甲醇、水、乙腈作為流動相對試樣進行分離檢測，實驗結果表明：選用甲醇和水作為流動相比用乙腈、水作為流動相或甲醇、水、乙腈混合流動相，分離效果更好、色譜峰更尖銳。因此選用甲醇、水作為為流動相；同時采用梯度洗脫程序：在MI和CMI出峰后，調高流動相中甲醇的比例，加快其它雜質峰的洗脫，減少流動相消耗。MI和CMI的MRM色譜圖如圖2所示。

圖2 MI和CMI的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram for MI and CMI

2.3 樣品前處理方法的優化

2.3.1 萃取劑的選擇

研究表明，由于再造煙草樣品為含水率低的粉末，采用一定量的水潤濕有利于MI和CMI的提取。進一步的實驗發現，為了將2 g的煙末完全潤濕，水的體積大致在10 mL左右。

經查閱文獻[10-15]表明，MI和CMI一般采用丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、水等溶劑定容，實驗分別采用丙酮、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、水和甲醇對再造煙葉進行萃取。結果如圖3所示，MI和CMI在水和醇類中溶解度較好，綜合考慮，我們選擇甲醇作為提取溶劑。進一步的實驗發現，當稱樣量為2g、萃取劑甲醇的體積為10 mL時萃取效果最好。

圖3 不同溶劑的萃取效率Fig.3Extraction efficiency of different solvents

2.3.2 提取方式的選擇

采用不同的提取方式，一般不會對自由態提取目標的回收率造成影響，只會存在提取時間的差異。漩渦振蕩是一種新興的提取方式，其振蕩頻次可達到2000 rpm，是普通旋轉振蕩的10倍，極大地縮短了振蕩時間、提高了萃取的效率，并被QuEChERS前處理方法所采納。因此，本文最終選用了漩渦振蕩來作為提取方式，而進一步的實驗摸索發現2 min的振蕩時間已能使提取達到完全。

2.3.3 緩沖鹽體系的選擇

在QuEChERS前處理方法中，常用的鹽析試劑包有：

A：4gMgSO4+ 1gNaCl（無緩沖鹽）

B：4gMgSO4+ 1gNaCl + 1gNa3Cit·2H2O + 0.5gNa2HCit·1.5H2O（檸檬酸緩沖鹽體系）

C：4gMgSO4+ 1gNaOAc（醋酸緩沖鹽體系，提取溶劑中要加入1%體積的醋酸）

對不同的鹽析試劑包進行比較，結果發現：C鹽析試劑包回收率最低，A鹽析試劑包結果不穩定，B鹽析試劑包回收率最高。因此，本文最終選用了檸檬酸鹽緩沖體系。

2.3.4 凈化吸附劑的選擇

在QuEChERS前處理方法中，常用的凈化劑有PSA、C18E、GCB等。對不同凈化劑進行考察，結果如圖4所示：PSA的凈化效果較好，且回收率較高。因此，本文最終選擇PSA作為凈化劑。

圖4 不同凈化劑的回收率比較Fig.4 Recovery rate comparison of different purification agent s

2.3.5 標液及樣品穩定性

考察放置時間、溫度等對甲基異噻唑啉酮及其氯代物檢測的影響，結果發現：甲基異噻唑啉酮及其氯代物化學性質比較穩定，溫度及時間對測定結果影響不大。

2.4 方法的驗證

2.4.1 線性關系

配制MI、CMI質量濃度均為0.05、0.l0、0.50、1、5、l0 mg/L的系列混合標準溶液，并對其分別進行測定，以目標物的峰面積Y，對其質量濃度X(mg/L)進行回歸分析，得到MI、CMI的線性回歸方程，結果如表2所示。按信噪比(S/N)大于10來確定MI和CMI的儀器定量限分別為 2.5 μg/L、2.8 μg/L。

表2 M1和CMI的線性回歸方程和決定系數Tab.2 Linear regression equation and coefficient of determinat ion for M1 and CMI

2.4.2 重復性實驗

為了考察方法的重復性，對一樣品重復測定，重復做3天，每天進行了6次平行測定，結果如表3、4所示，相對標準偏差(RSD)小于5%。

表3 MI重復性試驗Tab.3 Repetition test of MI

表4 CMI重復性試驗Tab.4 Repetition test of CMI

2.4.3 回收率實驗

在同一樣品中，按樣品質量加入3個濃度水平的標樣，混勻，各測定3次，結果如表5、6所示，回收率分別為95.2%、92.3%，符合化學檢測要求。

表5 MI回收率試驗Tab.5 Recovery rate test of MI

表6 CMI回收率試驗Tab.6 Recovery rate test of CMI

2.4.4 樣品的測定

按上述方法對20個再造煙葉樣品進行檢測，結果如表7所示，在部分樣品中檢出了甲基異噻唑啉酮及其氯代物，檢出率為30%，檢測值分別在0.314～4.589 mg/kg和0.286～2.365 mg/kg之間。并與常規的HPLC/PDA檢測方法進行比對試驗，兩組檢測結果經t檢驗后發現：t（MI）=0.479<1.812、t（CMI）=0.254<1.812 (置信區間小于0.05)，說明兩種檢測方法無顯著性差異；但是采用HPLC/PDA方法在9#、12#、17#、18#樣品中出現的目標峰經UPLC/MS/MS方法確認為假陽性，說明UPLC/MS/MS法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物較HPLC/PDA法更為可靠。

表7 部分有檢出的樣品檢測結果Tab.7 Test results of some samples

3 結論

以QuEChERS為樣品前處理方法，建立了HPLC/MS/MS法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物的方法。該方法線性良好，決定系數r2>0.99，回收率分別為95.2%、92.3%，RSD<5%。

采用該方法在部分樣品中檢出了甲基異噻唑啉酮及其氯代物。該方法填補再造煙葉中甲基異噻唑啉酮及其氯代物檢測的技術空白，且操作簡單、效率高、適合應用。

[1]莫立煥，陳克復．殺菌防腐劑在造紙工業中的應用概述[J]．造紙化學品，2004，2:7-10．

[2]于良民，姜曉輝．異噻唑啉酮類化合物及其在海洋防污涂料中的應用[J]．涂料工業，2004，35(5):43．

[3]司新生，楊俊偉，杭磊．日化級異噻唑啉酮類殺菌防腐劑皮膚刺激實驗及其機理的研究[J].應用化工，2011，40(10):1789-1791．

[4]儲惠，夏寶風．異噻唑啉酮所致職業性接觸性皮炎1例報告[J].職業衛生與應急救援，2000，18(1):43-44．

[5]Jerschow E，Hostynek J J，Maibach H I．Allergic contact dermatitis elicitation thresholds of potent allergens in humans[J}.Food and Chemical Toxicology，2001，39:1095-1108．

[6]中華人民共和國衛生部．化妝品衛生規范[s]．北京：軍事醫學科學出版社，2007:240-24l.

[7]張建枚,潘亞男,白樺.UV法測定異噻唑啉酮衍生物活性物含量[J].工業水處理,2011,05:70-71,75.

[8]陸軍,矯筱蔓,佟曉波,龐燕軍,李瑩.氣相色譜法同時測定化妝品中15種防腐劑[J].日用化學工業,2012,02:146-149.

[9]孫忠松,杜恒清,劉寶,王駿.氣相色譜-離子阱質譜法分析紙質食品包裝材料中的甲基異噻唑啉酮殺菌防腐劑[A].山東出入境檢驗檢疫局專刊[C].2012:4.

[10]王超,張青,王星.化妝品中甲基異噻唑啉酮及其氯代物的高效液相色譜測定法[J].環境與健康雜志,2007,06:449-450.

[11]劉文光,李云芝,石瑞常,胡自江,衣葵花.高效液相色譜法測定蠶用異噻唑啉酮溶液含量[J].安徽農業科學,2009,32:15667-15668.

[12]林芳,李小婭,陳斌.HPLC-DAD檢測皮革中異噻唑啉酮含量的不確定度分析[J].西部皮革,2013,04:35-39.

[13]趙美麗.HPLC法測定化妝品中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物[J].江西化工,2013,04:188-195.

[14]張志成,張耀元.HPLC法同時測定化妝品中的12種防腐劑[J].香料香精化妝品,2014,02:44-50.

[15]楊榮靜,衛碧文,于文佳,高歡,孫曉娟.液相色譜-串聯質譜法檢測玩具中的3種異噻唑啉酮類防腐劑[J].色譜,2011(06):513-516.

Determination of Methylisothiazolinketone and its chlorides in reconstituted tobacco by HPLC/MS/MS

HUANG Huafa,ZHANG Jianping,HUANG Chaozhang,XIE Wei,DENG Qixin,WU Qinghui,LIU Xiucai,YE Zhongli,LIU Zechun

Technology Center of China Tobacco Fujian Industrial CO.,Ltd.,Xiamen 361021,Fujian,China

A HPLC/MS/MS chromatography method for the determination of methylisothiazoketone and methyl chloroisothiazole morphlinone in reconstituted tobacco was developed.Samples were extracted with methanol,separated on C8 column,and then detected by HPLC/MS/MS under MMR model.Good linearity was obtained between 0.05～l0 mg/L.,and the limits of detection were 2.5 μg/L for MI and 2.8 μg/L for CMI,and RSD was <5% and the recoveries were 95.2% for MI and 92.3% for CMI.The method proved simple,fast,accurate,reliable，and applicable to quantitative analysis．

HPLC/MS/MS；reconstituted tobacco；Methylisothiazolinketone；Methylchloroisothiazole Morphlinone

黃華發，張建平，黃朝章,等.液相色譜串聯質譜法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物[J].中國煙草學報，2015,21（3）

黃華發（1983—），本科，工程師，主要從事煙草化學研究，Tel：0592-3170716， Email:hhf10520@fjtic.cn

劉澤春（1976—），碩士，高級工程師，主要從事煙草化學研究，Tel：0592-3170718，Email:lzc10497@fjtic.cn

2014-12-17

: HUANG Huafa,ZHANG Jianping,HUANG Chaozhang,et al.Determination of Methylisothiazolinketone and its chlorides in reconstituted tobacco by HPLC/MS/MS [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)