GC-TEA法測定卷煙主流煙氣TSNAs前處理方法的改進

張霞，朱東來，韓熠，雷萍，楊光宇，鞏效偉，李壽波，段沅杏，韓敬美，陳永寬

新型煙草制品研究所，云南中煙技術中心，昆明，650231

GC-TEA法測定卷煙主流煙氣TSNAs前處理方法的改進

張霞，朱東來，韓熠，雷萍，楊光宇，鞏效偉，李壽波，段沅杏，韓敬美，陳永寬

新型煙草制品研究所，云南中煙技術中心，昆明，650231

為改進氣相色譜-熱能分析聯用法（GC-TEA）法測定卷煙主流煙氣TSNAs的前處理方法，依托改良的索氏提取器將原方法中的提取、濃縮、柱層析凈化、再濃縮四步有機結合，然后對卷煙主流煙氣中的TSNAs進行測定。結果表明：①在10～ 4000 ng/mL的濃度范圍內，4種TSNAs回歸曲線的線性相關系數均大于0.999，該方法檢測限在0.12～0.15 ng/cig之間，回收率在92.0%～102.3% 之間，日內相對標準偏差在3.06%～5.80% 之間，日間相對標準偏差在3.40%～6.93% 之間；②將本方法與CORESTA N° 63方法進行比較，兩者結果無顯著性差異。本方法采用改良的索氏提取器進行樣品前處理可避免多次轉移、濃縮，簡化了操作步驟，縮短了前處理時間，有效減少分析誤差，且有機溶劑用量大大減少，減少了對環境的污染，結果準確可靠，適用于主流煙氣中TSNAs的分析檢測。

改良的索氏提取器；氣相色譜-熱能分析聯用法；主流煙氣；煙草特有亞硝胺

煙草特有亞硝胺(TSNAs)是卷煙煙氣中可能會誘發癌癥的主要活性成分之一[1-2]，主要包括N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-（甲基亞硝基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)等。國際癌癥研究機構（IARC）確定NNN、NNK致癌性等級為I類，NAB、NAT致癌等級為3類[3-7]。隨著人們對吸煙與健康問題的關注，卷煙產品的安全、衛生越來越得到各方面的重視，因此，測定卷煙煙氣中TSNAs的釋放量具有重要的意義。

由于烤煙型卷煙主流煙氣中的TSNAs濃度很低，一般均在ng/支數量級，而且卷煙主流煙氣樣品背景復雜，化學成分繁多，要準確定性定量測定TSNAs難度很大。目前，檢測卷煙主流煙氣中TSNAs的分析方法主要有氣相色譜-熱能分析聯用法(GC-TEA)[8-9]、氣相色譜-質譜聯用法(GC/MS)[10-12]和液相色譜-串聯質譜聯用法(LC-MS/MS)[13-14]等。LC-MS/MS法具有較高的靈敏度，但基質效應對分析物造成不利影響。GC-MS法重現性較好，但樣品前處理非常麻煩。GC-TEA法對亞硝胺類化合物具有很好的選擇性，測定結果準確，但樣品前處理非常復雜、耗時較長，需多次的轉移、濃縮，易造成TSNAs的損失和轉化，影響測定的準確性，而且有機溶劑（二氯甲烷）消耗量很大，樣品前處理過程中大量溶劑向空氣中散發，環境污染大。針對現有技術的不足，本文依托改良的索氏提取器[15]對現有的GC-TEA法測定卷煙主流煙氣TSNAs的前處理方法進行了改進，簡化了樣品前處理操作步驟，顯著減少了前處理過程中有機溶劑用量，避免了樣品處理過程中的環境污染。測定結果與CORESTA N° 63方法進行了對照，結果無顯著性差異。

1 實驗部分

1.1 材料

參比卷煙2個(1R5F和2R4F)；國內市售卷煙15個（其中烤煙型卷煙10個，混合型卷煙5個）。

1.2 儀器的結構與流程

改良的索氏提取器具體結構見圖1，該裝置由回流冷凝管1、提取器3和燒瓶8三部分組成，燒瓶8的底部設有一段1～2 mL的尾管7，提取器3是由溶劑汽流管4和填料管15上部相連而成的U形管，溶劑汽流管4下端接燒瓶磨口5，填料管15中裝有篩板11。填料管15上端接回流冷凝管1，下端的管件通過三通閥10后接于燒瓶8，三通閥10的另一出口接溶劑回收口9，回流冷凝管1的液滴出口垂直正對填料管15上方。

提取器3為異徑的U形管，溶劑汽流管4的管徑為18～22 mm，填料管15的管徑為30～35 mm，提取器3與回流冷凝管1相接的磨口2至填料管底部的距離為160～200 mm。

篩板11上放置柱層析材料氧化鋁層12和無水硫酸鈉層14，氧化鋁層14的厚度為50～70 mm，直接放置在篩板上，樣品層13置于氧化鋁層和無水硫酸鈉層之間。燒瓶7中加入溶劑6，加熱回流時溶劑6通過三通閥10回到圓底燒瓶8，轉動三通閥10至溶劑回收口9，溶劑6則可從回收出口流出。

圖1 改良的索氏提取器的結構圖Fig.1 Structure diagram of improved soxhlet extractor

1.3 儀器與試劑

氯仿（色譜純）：美國sigma公司；無水甲醇（分析純），無水硫酸鈉（分析純），丙酮（分析純），堿性氧化鋁（200目～300目）：國藥集團化學試劑有限責任公司；N-戊基-（3-甲基吡啶基）亞硝胺、NNN、NAT、NAB、NNK純品（純度大于97%）：百靈威化學試劑公司。

分析天平（感量0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司）；RM200轉盤式吸煙機（德國Borgwaldt公司）；92mm劍橋濾片（英國Whatman公司）；氣相色譜-熱能分析聯用儀（美國Thermo Electron公司）；色譜柱，彈性毛細管柱30 m× 0.53 mm× 1 μm，固定相為50%甲基-50%苯基聚硅氧烷；保護柱，彈性石英毛細管柱 1m × 0.53mm，經脫活處理。

1.4 標準工作溶液

按下列濃度范圍配制TSNAs標準系列工作溶液，以氯仿為溶劑，內標N-戊基-（3-甲基吡啶基）亞硝胺的濃度為400 ng/mL。

NNN，NAT，NNK：20 ng/mL，100 ng/mL，500 ng/mL，1000 ng/mL，2000 ng/mL，4000 ng/mL。

NAB：10 ng/mL，50 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，1000 ng/ mL，2000 ng/mL。

1.5 樣品前處理

采用20孔道轉盤式吸煙機抽吸卷煙，根據GB/T 19609—2004規定的方法[11]采用92 mm劍橋濾片捕集20支卷煙主流煙氣的總粒相物。

在改良的索氏提取器中加入15 g堿性氧化鋁層，將劍橋濾片折疊后放在堿性氧化鋁層上面，再在濾片上面鋪2.5 g無水硫酸鈉；在燒瓶中加入150 mL丙酮與氯仿（V:V=2:8）的混合溶劑，再加入1 mL內標溶液，然后將改良的索氏提取器放入水浴鍋中在75℃下加熱回流40 min，直至燒瓶尾管中的樣品溶液約為1 mL。將收集到的樣品溶液轉入2 mL樣品瓶，按GB/T 23228—2008規定的GC-TEA分析條件進行檢測。

1.6 儀器條件

本方法所采用的是GB/T 23228—2008規定的色譜條件，具體如下：

程序升溫：初始溫度150℃，保持2 min；以3℃/min速率升至230℃，20℃/min速率升至260℃，保持20 min；進樣口溫度：230℃；載氣：氦氣，恒流10 mL/min進樣量：2 μL，不分流，不分流時間：1 min，吹掃流量：50 mL/min；熱裂解溫度：550℃；接口溫度：250℃。

標樣和卷煙煙氣樣品色譜圖見圖2。

圖2 標樣 (a)和卷煙煙氣樣品(b)色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard solution sample (a) and mainstream cigarette smoke sample (b)

2 結果與討論

2.1 方法原理

用GC-TEA法測定卷煙主流煙氣中的TSNAs，樣品前處理分為樣品提取、濃縮、凈化、再濃縮四步；具體操作步驟為：捕集了卷煙主流煙氣總粒相物的濾片用二氯甲烷提取，提取液進行濃縮，濃縮液加到氧化鋁層析柱上，用二氯甲烷-甲醇為洗脫劑洗脫凈化，柱層析凈化后的流出液再濃縮，然后供儀器分析用。而采用本文中的裝置，啟動水浴鍋加熱，溶劑蒸發后再經回流冷凝管(圖1中1)冷凝回到提取器中；溶劑經無水硫酸鈉層(圖1中14)干燥，然后再把劍橋濾片(圖1中13)上捕集的TSNAs洗脫下來；經過下面的堿性氧化鋁柱(圖1中12)凈化，這樣雜質保留在堿性氧化鋁柱上，而TSNAs則被溶劑洗脫下而進入圓底燒瓶中，經過一段時間的回流提取，樣品中的TSNAs被完全提取，轉換三通閥，讓溶劑從溶劑回收出口流出，這樣圓底燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當濃縮到約1 mL時停止加熱，取出樣品，即可供分析用。

2.2 萃取、凈化溶劑的選擇

TSNAs測定樣品前處理的關鍵步驟是氧化鋁柱層析凈化，溶劑的選擇非常重要，溶劑對氧化鋁柱的洗脫強度適當才能讓TSNAs從氧化鋁柱上洗脫，并讓雜質更多的保留在柱上，從而達到樣品凈化的目的。傳統方法一般用一種洗脫強度小的溶劑(二氯甲烷)和一種洗脫強度大的溶劑(甲醇)混合作為洗脫劑，通過兩者的比例調節洗脫強度。在本方法中，要求兩種溶劑的沸點相近，以保持在水浴加熱時能達到基本同時氣化。氯仿的沸點(61.3℃)和丙酮的沸點(56.5℃)非常接近，經常使用這兩種溶劑混合調節溶劑強度作為正相色譜的流動相，因此選擇氯仿和丙酮混合作為本實驗中的提取、凈化溶劑。試驗了不同比例的氯仿和丙酮混合對烤煙型、混合型卷煙煙氣樣品中TSNAs的萃取效率的影響，見圖3、圖4，結果表明：丙酮的比例過低會導致柱上的亞硝胺洗脫不完全，使測定結果偏低，丙酮的比例過高又會導致大量雜質洗脫而達不到預期的凈化效果；丙酮和氯仿的比例在20:80時能將樣品中的TSNAs完全萃取，且能達到較好凈化效果，因此，本實驗中選擇體積比為2:8的丙酮-氯仿作為前處理中的溶劑。

圖3 萃取溶劑體積比對烤煙型卷煙主流煙氣中TSNAs萃取效果的影響Fig.3 Effect of volume ratio of extraction solvent on determina tion of TSNAs in flue-cured cigarette smoke

圖4 萃取溶劑體積比對混合型卷煙主流煙氣中TSNAs萃取效果的影響Fig.4 Effect of volume ratio of extraction solvent on determina tion of TSNAs in blended cigarette smoke

2.3 萃取劑體積的選擇

在本實驗中，需在提取裝置中加入足夠量的溶劑，以保持溶劑在前處理過程中能循環，實驗表明，當提取裝置中的溶劑量達120 mL時能保持正常循環，但考慮到在樣品前處理過程中溶劑因蒸發而有少量損失，因此選擇在提取器中加入150 mL的氯仿-丙酮混合溶劑。

2.4 水浴溫度的選擇

在本實驗中，氯仿的沸點為61.3℃，丙酮的沸點為56.5℃，當水浴溫度超過70℃時，尾管燒瓶中的溶劑開始沸騰，隨溫度增加，溶劑蒸發速度迅速加快，當溫度達到75℃時溶劑蒸發速度能達到10 mL/min左右（稍大于氧化鋁柱上的流下速度），溫度過高則會增加提取過程中的溶劑損失，因此，實驗選擇水浴溫度為75℃。

2.5 萃取時間的選擇

選取烤煙型、混合型卷煙樣品各一個，采用RM200 轉盤式吸煙機進行抽吸后將捕集有TSNAs的劍橋濾片在75℃的水浴中進行回流提取，考察提取時間對TSNAs測定結果的影響。比較了提取時間分別為20、25、30、35、40、45、50 min的測定結果，如圖5、圖6所示。結果表明：萃取時間為20 min時，由于樣品萃取不完全導致結果偏低，40 min以后萃取效率達到一個穩定值，為節約時間并避免引入更多的干擾成分，因此，選擇40 min 作為提取含有TSNAs的劍橋濾片的最佳時間。

圖5 萃取時間對烤煙型卷煙流煙氣TSNAs測定結果的影響Fig.5 Effect of extraction time on determination of TSNAs in fl uecured type cigarette smoke

圖6 萃取時間對混合型卷煙流煙氣TSNAs測定結果的影響Fig.6 Effect of extraction time on determination of TSNAs in blended cigarette smoke

2.6 定量校正曲線及方法的檢測限

6級校正溶液分析后，建立了內標法校正曲線。在10～4000 ng/mL 的范圍內，4種TSNAs的線性相關系數均大于0.999，表明本方法擁有較寬的、良好的線性范圍。上述濃度范圍相當于每支卷煙主流煙氣中NNN、NNK、NAT、NAB含量為0.5～200 ng/cig，覆蓋的樣品含量范圍廣，基本可以滿足所有卷煙樣品的分析測定。

將最低濃度的標準溶液連續進樣10次，測定其標準偏差，以3倍標準偏差作為檢出限，以10倍標準偏差作為定量限。具體結果見表1。

表1 本方法的線性范圍、相關系數及檢測限Tab.1 Linear range,correlation coefficients,and LOQ

2.7 方法的精密度和回收率

選取烤煙型、混合型卷煙樣品各一個，進行5次日內和日間平行性測定，如表2所示。結果表明，4種TSNAs日內、日間測定結果的相對標準偏差分別在3.06%～5.80% 和 3.40%～6.93% 之間，說明本方法的重復性較好。

表2 方法的重復性結果Tab.2 Results from repeatability test ng/cig

選取烤煙型、混合型卷煙各一個樣品，以其實際含量的約20%、50%、100%加入標準物質，測定本方法的樣品加標回收率，結果列于表3。烤煙型卷煙主流煙氣中4種TSNAs的回收率在92.0%～102.0%之間，混合型卷煙主流煙氣中4種TSNAs回收率在93.8～102.3%之間，說明本方法的樣品加標回收率良好。

表3 本方法的回收率試驗結果Tab.3 Recovery rate

續表3

2.8 本方法和 CORESTA方法的對比

將本方法的前處理時間和溶劑消耗量與CORESTA N° 63方法進行對比，結果見表4，從表中可以看出采用本方法明顯縮短了前處理的時間，提高了工作效率，減少了前處理過程中有機溶劑用量，且精密度高于CORESTA N° 63方法，主要是由于改良的索氏提取器將傳統方法中的提取、濃縮、柱層析凈化、再濃縮四步有機結合起來，有效減少了分析誤差，提高了方法的精密度。

表4 本方法和 CORESTA N° 63方法的比較結果Tab.4 Comparison with CORESTA N° 63 method

3 實際樣品的測定及與CORESTA方法的比對

3.1 參比卷煙主流煙氣中 TSNAs的測定

采用本方法測定了1R5F和2R4F卷煙主流煙氣中TSNAs的釋放量，并與2006年CORESTA組織的17家實驗室共同實驗數據平均值進行了比較，結果見表5。由表5可知，采用本方法的測定結果與CORESTA共同實驗結果具有較好的一致性。

表5 參比卷煙主流煙氣中的TSNAs檢測結果比較Tab.5 Comparison of TSNAs in reference cigarettes mainstream smoke ng/cig

3.2 卷煙主流煙氣中 TSNAs的測定

采用本方法和CORESTA N° 63方法測定了國內市場銷售的15個卷煙樣品主流煙氣中TSNAs的釋放量，將各樣品含量進行比較。由表6可以看出，采用本方法對樣品進行測定的結果與CORESTA方法的測定結果進行成對t檢驗，4種TSNAs的t檢驗值均大于0.05，表明兩種方法的測定結果無顯著性差異。

表6 本方法及 CORESTA N° 63方法測定國內卷煙主流煙氣中TSNAs的結果比較Tab.6 Comparison of TSNAs in domestic cigarette smoke detect ed by this method and by CORESTA N° 63 method ng/cig

4 結論

本研究依托改良的索氏提取器對GC-TEA法測定卷煙主流煙氣TSNAs的前處理方法進行改進。采用改良的索氏提取器可將原方法中的提取、濃縮、柱層析凈化、再濃縮四步有機結合，避免了樣品前處理過程中的多次轉移、濃縮，簡化了操作步驟，可有效減少分析誤差，使測定結果更加準確，而且樣品處理在相對封閉的裝置中完成，避免了GB/T 23228—2008（或CORESTA N° 63）前處理方法中許多敞開操作，減少了環境污染。采用本方法在10～4000 ng/mL的濃度范圍內，4種TSNAs的線性相關系數均大于0.999，檢測限在0.12～0.15 ng/cig之間，回收率在92.0%～102.3% 之間，日內相對標準偏差在3.06%～ 5.80% 之間，日間相對標準偏差在3.40%～6.93%之間，說明本方法的回收率高，重復性好；且本方法的測定結果與CORESTA N° 63方法進行了配對t檢驗，結果無顯著性差異，說明本方法準確可靠，適用于主流煙氣中TSNAs的分析檢測。

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Improvement of pretreatment method for determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke by GC-TEA

ZHANG Xia,ZHU Donglai,HAN Yi,LEI Ping,YANG Guangyu,GONG Xi aowei,LI Shoubo,DUAN Yuanxing,HAN Jingmei,CHEN Yongkuan
Non-traditional Tobacco Products Institute,Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial CO.,Ltd,Kunming 650231,China

In order to improve pretreatment method for the determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke by GC-TEA，improved soxhlet extractor was used to pre-treat mainstream cigarette smoke samples which combined four steps of extraction,concentration,column chromatography pufication and re-concentration traditionally used.Results indicated that: 1) with concentration range of 10-4000 ng/mL,the linear correlation coefficients of four TSNAs regression curves were higher than 0.999.The limits of quantification of this method ranged from 0.12 to 0.15 ng/cig,the recoveries were from 92.0% to 102.3% ,the intra-day relative standard deviations(RSD) were between 3.06% and 5.80%,and the inter-day RSD were between 3.40% and 6.93%.2) No significant difference was detected compared with CORESTA N° 63 method.Repeated transferring and concentrating steps could be avoided.Therefore this method was suitable for the determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke as it featured more accuracy and better reliability as well as simplified operation steps,shorted pretreatment time,less organic solvents,reduced analysis errors.

improved soxhlet extractor;GC-TEA;mainstream cigarette smoke;tobacco-specific N-nitrosamines

張霞，朱東來，韓熠,等.GC-TEA法測定卷煙主流煙氣TSNAs前處理方法的改進[J].中國煙草學報，2015,21（3）

云南中煙新型煙草制品研發及其共性技術研究（2014CP02）

張霞（1984—），碩士，助理研究員，主要從事新型煙草制品研究，Email：zhangxia840511@163.com

陳永寬（1966—），博士，研究員，主要從事新型煙草制品研究，Email:cyk1966@163.com

2014-04-25

: ZHANG Xia,ZHU Donglai,HAN Yi,et al.Improvement of pretreatment method for determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke by GC-TEA [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)