持續被動運動對兔膝關節損傷后側副韌帶內彈性蛋白表達的影響

孫青青，周愛萍

骨關節損傷或關節軟骨損傷后，主要表現為關節疼痛、腫脹、僵硬和功能障礙并可逐漸發生退行性變。部分患者因害怕疼痛未能進行早期的康復訓練，致局部肌腱、韌帶、關節囊等軟組織與關節廣泛粘連，使得關節屈伸、旋轉功能受阻，限制了正常的關節運動，影響關節功能的恢復［1-2］。本研究以新西蘭大白兔為研究對象建立膝關節全層缺損模型，觀察6周持續被動運動(continuous passive motion，CPM)對膝關節損傷后周圍組織(側副韌帶)內彈性蛋白的影響，為臨床常規使用CPM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組 實驗的新西蘭雄性大白兔15只由青島康大公司提供，兔齡為70 d，體重為1.165～2.335 kg，麻醉采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)，在兔兩后退膝關節髕骨內側作2 cm的弧形切口，逐層切開，暴露股骨髕骨面，在其中心處用電鉆致其關節軟骨全層缺損，深度以缺損區有滲血為準。見圖1。用生理鹽水沖凈軟骨碎片及凝血塊，逐層關閉切口，滅菌紗布覆蓋包扎。術后隨機分成3組即制動組、自由活動組、CPM組，每組5只含10個膝關節。制動組采用自制襪套屈膝固定，見圖2。

圖1 兔膝關節軟骨全層缺損造模

圖2 襪套制動免后腿造模

1.2 術后處理 術后所有兔子連續注射3 d青霉素(40萬U/次，2次/d)。制動組采用襪套，屈膝位制動6周;自由活動組籠內活動6周;CPM組籠內自由活動并每天上下午各1 h CPM儀運動6周，運動的起始角度為 20°，速度為 8°/s［3］，在其耐受范圍內逐漸增加角度，最大角度為100°。

1.3 蛋白免疫印跡(western blotting)彈性蛋白的檢測 6周后采用靜脈注射空氣處死所有兔子取其膝關節側副韌帶，所有標本保存在－80℃。蛋白提取:取出標本先將其剪碎，迅速充分研磨后加入細胞裂解液，1300 r離心4 min，離心機半徑為95 mm。取上清液，保存在－20℃，采用NanoDrop分光光度計測量各組標本蛋白的濃度，光波長度設定為280 nm。采用western blotting檢測彈性蛋白的表達:聚丙烯酰胺凝膠電泳采用5%濃縮膠、10%分離膠，上樣量20 μg，電壓80 V，電泳結束后取出凝膠。半干法轉印:恒流2 mA/cm2下轉膜70 min，確保轉膜成功;轉移至5%的封閉液中，室溫下平緩搖動2 h，加入彈性蛋白一抗，放入冰箱4℃過夜;TBST緩沖液漂洗硝酸纖維素薄膜3次，每次10 min;加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫下孵育2 h，TBST漂洗硝酸纖維素薄膜3次，每次10 min。DAB顯色:將硝酸纖維素薄膜置于暗盒中均勻的滴上DAB顯色劑，反應10 min;將硝酸纖維素薄膜放入掃描儀中成像，βactin為內參，進行灰度值的分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件包進行數據處理，定量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，各組彈性蛋白比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體重比較 三組兔子術前體重為(2.014±0.194)kg，組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。術后CPM組兔子能安靜耐受2 h的訓練，訓練期間飲食正常;自由活動組一切如常;制動組兔子膝關節均出現僵硬、伸屈活動受限，食欲明顯下降，6周后平均體重較術前減少，但與術前比較差異仍沒有統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組兔術前、術后6周體重的比較(kg，±s)

表1 各組兔術前、術后6周體重的比較(kg，±s)

組別 n 術前 術后6周5 2.17 ±0.25 2.06 ±0.32自由活動組 5 2.00 ±0.18 2.97 ±0.18 CPM組制動組5 2.01 ±0.25 2.54 ±0.16

2.2 彈性蛋白表達的比較 western blotting所得電泳條帶的顏色越深表明其蛋白的表達越高，三組中彈性蛋白電泳條帶的灰度值分別與其相對應的βactin電泳條帶的灰度值相比，三組的彈性蛋白平均表達量分別是制動組(0.84±0.25)，自由活動組(2.91 ±0.34)，CPM 組(2.04 ±0.69)。制動組彈性蛋白的表達均低于自由活動組和CPM組(P＜0.01)，而CPM組彈性蛋白的表達低于自由活動組(P ＜0.01)。見圖3。

圖3 彈性蛋白的表達

3 討論

3.1 彈性蛋白的功能 彈性蛋白通常分布在結締組織、血管、肺泡壁等組織中，是一種無定形彈性體，賦予組織彈性、伸縮性等功能［4］。膝關節軟骨損傷往往不能自發修復，并且軟骨破壞不會局限、停止，其逐漸發展、擴大，嚴重者發展成為骨性關節炎，引起關節長期疼痛、關節韌帶的攣縮和關節功能障礙，如果較長時間不運動，會導致血運不暢，滲出的漿液纖維蛋白留在關節囊產生沉積易形成纖維組織致粘連，最終形成瘢痕導致韌帶攣縮、關節僵硬等［5-7］。當膝關節的功能發生改變時，作為內部結構功能基礎之一的彈性蛋白是如何隨之改變，正是本研究想要探討的。

3.2 CPM的特點與運用 Salter等［8］于20世紀70年代提出滑膜關節持續被動運動理論，并將其應用于關節軟骨缺損后的修復過程，發現可起到加速關節周圍的韌帶和肌腱的愈合與再生的滿意療效。CPM作為軟骨損傷的一種輔助治療方法，具有藥物和手術不能替代的獨有優勢，逐漸受到國內外相關專業與機構的重視和應用，其所給予的大范圍被動周期性正弦曲線性緩慢運動，使肌肉凝膠成分如水和蛋白多聚糖黏稠度減低，肌肉的被動僵硬程度減少，致使彈性增加、攣縮及痙攣得到有效緩解，故被廣泛應用于預防和治療關節粘連、僵硬、肌肉攣縮、骨質疏松等方面［9-12］，但從分子水平來證實CPM療效的報道目前較少見。

3.3 彈性蛋白的檢測與CPM臨床意義 本研究中制動組所有膝關節在術后6周均有瘢痕組織形成，而出現了僵硬等功能障礙，是較長時間缺乏鍛煉，血運循環差造成，與學者郭祁等［13］的研究一致。6周后所有實驗兔的體重與術前相比較差異沒有統計學意義，但制動組的平均體重明顯降低，這與術后制動舒適度降低，傷口的疼痛等影響了食欲進而導致體重的下降有關;消瘦也會消耗體內蛋白影響術后的恢復，由此出現局部影響帶動全身的平均體重下降，由此我們在實驗中關注了體重的變化。Salter等［8］的實驗證明，對于制動所引起的并發癥作CPM能夠起到很好的預防作用。實驗6周后各組間彈性蛋白表達的差異說明:CPM和自由活動可以防止因制動產生的關節僵硬、韌帶攣縮等，自由活動組的數據提示效果更好，這可能與兔子本身運動的強度比CPM大有關。也有研究顯示患者術后恢復過程中進行CPM，能夠有效提高鍛煉的效果，保證患者鍛煉天數的持續性和有效性，有利于促進患者膝關節功能的恢復和提高，且恢復的效果明顯比自主鍛煉好［14］。Chang等［15］在CPM治療和非細胞聚丙交酯-乙交酯共聚物植入兔軟骨再生的聯合效應中發現，CPM能有效防止關節周圍組織痙攣的形成。本研究中除制動組外其他組無一例有痙攣現象發生，提示術后早期的康復訓練可以增加韌帶強度功能鍛煉，對減少關節粘連，防止關節僵硬，肌肉萎縮等并發癥有加速康復作用。

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