FSHβ基因-211G→T多態性與多囊卵巢綜合征的相關性研究

宋倩倩，楊夢云，趙學科，邱慧玲

多囊卵巢綜合征(polysistic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的異質性內分泌疾病，發病率5% ～10%［1］。PCOS臨床表現復雜多樣，如月經稀發甚至閉經、無排卵、高雄激素血癥、胰島素抵抗等，其并發癥也表現各異，不僅2型糖尿病、糖耐量受損及代謝綜合征的發生率較高［2-3］，而且子宮內膜癌、妊娠及新生兒并發癥、心血管病等的發生風險也高于正常人群［4-6］，PCOS的病因至今尚未闡明。基因多態性研究是近年來學者們研究的熱點，多數學者認為PCOS的發病可能與基因調控有關。卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)由α和β亞基組成，β亞基具有特異性并使FSH具有生物活性，由卵泡刺激素β亞基(follicle stimulating hormone β-subunit，FSHβ)基因編碼，FSH 對卵泡生長發育及排卵以及雄激素轉化為雌激素起到重要的作用。而PCOS患者內分泌特征有:雄激素過多、雌激素過多、黃體生成素與卵泡刺激素比值(luteinizing hormone/follicle stimulating hormone，LH/FSH)增大等。因此，FSHβ基因是PCOS病因研究的相關因素，但目前尚缺乏FSHβ-211G→T與PCOS的相關性研究。本研究特探討FSHβ-211G→T與PCOS的關系如下。

1 對象與方法

1.1 對象 病例組:收集2013年3－8月就診于廈門解放軍174醫院婦科的18～35歲PCOS 100例，均為福建省漢族人，診斷標準參照2003年歐洲人類生殖協會和美國生殖醫學協會推薦的診斷標準［7］，即:①稀發排卵或無排卵;②雄激素水平升高的臨床表現和(或)高雄激素血癥;③B超監測下的卵巢多囊改變，一側或雙側卵巢中直徑2～9 mm的卵泡數≥12個，和(或)單側卵巢體積增大＞10 mL;符合以上3條中的2條，并排除其他致雄激素水平升高的病因，包括先天性腎上腺皮質增生、分泌雄激素的腫瘤、庫欣綜合征等，以及其他引起排卵障礙的疾病，如高催乳素血癥、垂體或下丘腦性閉經、卵巢早衰、甲狀腺功能異常等。對照組:選擇同期因輸卵管因素(慢性輸卵管炎)不孕而就診的女性154例，入選標準為:年齡18～35歲、福建省漢族人;月經規律(25 d＜月經周期＜35 d);B超監測正常排卵;均無慢性疾病;至少3個月未服用過激素類藥物。本研究經174醫院倫理委員會批準，獲得每位研究對象的知情，并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒(Roche公司)，DNA聚合酶(北京全式金生物技術有限公司)，部分激素檢測試劑盒(瑞士 Roche公司);Unicel DXI 800化學發光免疫分析儀及配套生殖激素檢測試劑(BECKMAN COULTER公司)，Bioer lifepro PCR擴增儀(北京東方安諾生化科技有限公司)，Cavoy電泳儀(上海京工實業有限公司)，ABI3730測序儀(廈門閩博生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法 收集入選對象的年齡、血壓、腹圍、身高、體重、體質指數、月經史及B超監測排卵情況。所有入選對象至少3個月未服用過激素類藥物，均于月經來潮第2～3天(閉經者任何時期)，禁食12 h，抽取靜脈血，檢測血清FSH、LH、雌二醇(estradiol，E2)、孕激素(progesterone，P)、睪酮(testosterone，T)、泌乳素(prolactin，PRL)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、空腹胰島素(fasting insulin，FINS)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)，以及空腹總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL)、血清硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS)、性激素結合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)。以穩態模型評估-胰島素抵抗指數［8］(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。并于同樣條件下各抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，于－80℃儲存。

提取全血DNA，PCR總反應體積20 μL，上下游引物(l1 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板 4 μL、超純水9.4 μL、10 × Easytaq Buffer 2 μL、2.5 mM dNTPs 2 μL、Easytaq DNA Polymerase 0.6 μL;FSHβ-211G→T基因引物序列［英濰捷基(上海)有限公司合成］:上游引物為:5'-GGTAGTGATTATGGTTCTCCCTCAC-3'，下游引物為:5'-CCACTTGAAAACGGTAGATGC-3'。PCR擴增程序為:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次，72℃最后延伸5 min，擴增結束后存于4℃。取PCR擴增產物 2 μL，在瓊脂糖凝膠(1.2%)上，用穩壓100 V，電泳15 min，于凝膠成像分析儀上成像，進行基因測序，獲得突變位點基因序列，與已獲取的基因序列比對后，根據測序圖進行基因型鑒定。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，計量資料組間比較若符合正態分布采用t檢驗，不符合正態分布則采用Mann-Whitney U檢驗;計數資料以例(率)［n(%)］表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增及測序結果 PCR擴增目的基因片段長811 bp，于凝膠成像分析儀上成像見圖1。基因測序結果示FSHβ-211G→T基因變異有兩個基因型G/G及G/T(圖2)。

圖1 FSHβ-211G→T基因PCR產物凝膠成像

圖2 病例組和對照組FSHβ-211G→T基因測序結果

2.2 病例組和對照組的FSHβ-211G→T的基因型及等位基因分布 經Hardy-Weinberg平衡檢驗［9］，兩組等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。在PCOS人群中FSHβ-211G→T突變 GT基因型頻率為14.0%，對照組中 GT基因型頻率為6.5%，FSHβ-211G→T的基因型在兩組中的分布差異有統計學意義(P ＜0.05，表1)。

表1 兩組的FSHβ-211G→T的基因型及等位基因分布比較

2.3 不同FSHβ-211G→T基因型對病例組及對照組內分泌代謝指標的影響 攜帶GT基因型的患者較GG基因型患者具有低FSH水平及高LH/FSH比值(P＜0.05);同時在對照組中發現具有GT基因型者較GG基因型者具有高LH/FSH比值及高TC水平(P ＜0.05，表 2)。

3 討論

PCOS是育齡期婦女一種常見的異質性內分泌疾病，臨床表現及近遠期并發癥復雜多樣［2-6］，嚴重影響女性生殖及內分泌健康。但PCOS的病因至今尚未闡明，目前多數學者認為PCOS的發病可能與基因調控有關。人體內基因具有自然變異和多態性的特征，基因學研究有助于了解人類復雜疾病。最近被確認的FSHβ-211G→T，位于FSHβ基因啟動子區的第 211 個位點(rs10835638)［10］。有研究［11-12］表明，FSHβ-211G→T對生育期女性的下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic pituitary ovarian axis，HPO)有一定的影響，FSHβ基因和FSH受體(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)基因聯合突變可能會影響血清FSH水平。有研究［13］認為女性HPO軸有影響的基因變異對PCOS的相關表型也有一定的影響。

本研究發現FSHβ-211G→T基因變異具有兩個基因型GG及GT，在PCOS人群中FSHβ-211G→T突變GT基因型頻率為14.0%，T等位基因頻率高于對照組(PCOS為7.0%，對照組為 3.2%)，兩組間FSHβ-211G→T基因型分布存在差異(P＜0.05)，表明該單核苷酸位點多態性對PCOS的發病易感性有影響，并明確了FSHβ-211G→T基因多態性對PCOS的內分泌代謝有一定的影響。有學者研究發現［12］，FSHβ-211G→T突變基因T與高FSH水平及高LH水平相關。但本研究發現，FSHβ-211G→T與血清FSH水平之間的關系明顯不同于先前的研究，這可能與不同人種、不同地區群體的基因突變頻率差異及研究設計方案、分析方法的不同有關。在PCOS患者中FSHβ-211G→T多態性對 FSH及LH/FSH比值有影響，攜帶GT基因型的患者較GG基因型患者具有低FSH水平及高LH/FSH比值(P＜0.05)，同時TC水平也有上升趨勢;在對照組中攜帶GT基因型者較GG基因型者具有高LH/FSH比值及高TC水平(P＜0.05)，而FSH水平也有下降趨勢;該基因多態性對 LH、FPG、FINS、LDL、HDL、DHEAS、SHBG等指標無明顯影響。因此，筆者推斷FSHβ基因啟動子區的多態性通過影響FSH、TC水平來影響PCOS的內分泌代謝。根據Falck在1959年提出的學說［14］:在顆粒細胞中，FSH與顆粒細胞上的FSHR結合，激活顆粒細胞內的芳香化酶活性，將雄激素轉化為雌激素。因此筆者推測，FSHβ-211G→T通過影響FSH水平，改變PCOS體內雄激素和雌激素的水平，引起激素水平的紊亂，以致PCOS臨床內分泌代謝的變化，最終導致PCOS的發生。總之FSHβ-211G→T基因多態性對PCOS的發病易感性及臨床內分泌特征有影響，FSHβ-211G→T基因多態性可能是PCOS發病的原因之一。

表2 病例組與對照組不同FSHβ-211G→T基因型的內分泌代謝指標比較(±s)

表2 病例組與對照組不同FSHβ-211G→T基因型的內分泌代謝指標比較(±s)

注:與本組GG基因型比較，*P＜0.05

指標 病例組(n=100)對照組(n=154)GG GT FSH(mIU/mL) 6.77 ±1.93 5.18 ±1.41*GG GT 1.40 ±0.38 1.55 ±0.33 1.53 ±0.35 1.73 ±0.55 7.36 ±2.37 6.76 ±1.21 LH(mIU/mL) 10.78 ±6.53 11.91 ±6.85 4.37 ±1.99 7.45 ±7.20 LH/FSH 1.65 ±0.93 2.31 ±1.14* 0.65 ±0.37 1.06 ±0.87*E2(pg/mL) 39.98 ±21.45 35.71 ±18.67 39.99 ±24.06 40.40 ±19.46 T(ng/mL) 0.62 ±0.35 0.56 ±0.14 0.60 ±2.84 0.37 ±0.13 P(ng/mL) 0.91 ±0.72 0.79 ±0.40 1.18 ±2.59 0.85 ±0.30 PRL(ng/mL) 14.86 ±6.72 28.23 ±43.88 16.72 ±8.46 15.80 ±4.84 TSH(μIu/mL) 2.68 ±3.39 4.07 ±5.89 2.21 ±1.09 1.75 ±0.58 SHBG(nmol/L) 53.09 ±85.58 41.65 ±72.40 63.71 ±63.24 86.91 ±116.27 DHEAS(μg/dL) 306.95 ±60.34 321.50 ±63.67 308.41 ±138.31 326.52 ±113.69 FPG(mmol/L) 4.85 ±0.53 4.94 ±0.73 4.69 ±0.50 4.69 ±0.43 FINS(μU/mL) 11.27 ±6.75 13.08 ±8.88 8.31 ±7.82 8.16 ±3.50 HOMA-IR 2.44 ±1.64 2.88 ±2.50 1.76 ±1.69 1.71 ±0.78 TC(mmol/L) 4.74 ±0.77 5.17 ±0.85 4.86 ±0.79 5.43 ±0.75*TG(mmol/L) 1.76 ±4.30 1.34 ±4.32 0.98 ±0.74 0.96 ±0.70 LDL(mmol/L) 2.83 ±0.71 3.07 ±0.71 2.87 ±0.05 3.17 ±0.77 HDL(mmol/L)

本研究對FSHβ-211G→T與PCOS的相關性進行首次研究，選取的人群僅為中國福建漢族女性人群，具有一定的局限性，有待對更多地區、更多人種進行研究。

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