紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織MAPK信號通路的影響

張小琴，賴文芳，褚克丹，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

紅景天是薔薇目景天科紅景天屬亞灌木或多年生草本植物［1］，主要分布在高山地帶，因其生長環(huán)境惡劣，氣候多變，使其具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和生命力，有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的功效。紅景天苷是紅景天的主要活性成分，近年來對紅景天苷藥理作用方面的研究有了較大的進(jìn)展。研究表明紅景天苷具有廣泛的藥理作用，除了抗疲勞、抗腫瘤、抗微波輻射、抗衰老的功效，還有抗缺氧、抗肝纖維化、心腦血管系統(tǒng)保護(hù)、抗腎損害、增強(qiáng)記憶、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種藥理作用［2－3］。我們用基因芯片技術(shù)，從分子機(jī)制上對紅景天苷作用于局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達(dá)進(jìn)行研究，以闡明紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠組織MAPK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 紅景天苷由福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)室提供，純度98%以上。實(shí)驗(yàn)前用超純水配制，按50m g／k g腹腔注射給藥。基因芯片由上海康成生物工程有限公司提供。

1.2 動物 健康成年SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量250～350g，福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXK（閩）2009－0001。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：每籠5只；溫度：22℃～25℃；相對濕度：40%～70%；飲食：自由進(jìn)食水和飼料。

1.3 方法 大鼠20只，隨機(jī)分為3組：正常組、局灶性腦缺血組（模型組）、紅景天苷給藥組（給藥組）。實(shí)驗(yàn)采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MC AO）模型［4］，大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上。沿頸部正中切開皮膚，用鑷子鈍性分離皮下組織，分離到氣管前肌后，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，可見光滑的頸總動脈，分離出頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，用眼科剪將頸總動脈剪一小口，插入魚線，插入成功后，結(jié)扎頸內(nèi)動脈，插入深度距動脈分叉約2mm。在傷口處抹上慶大霉素，縫合傷口。將大鼠放入籠中，保溫處理，2h后再灌拔線。給藥后7d斷頭取腦，用刀片完整切出左腦（手術(shù)側(cè)），放入預(yù)先裝有RNAlater的凍存管中，置于液氮罐凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織mR NA質(zhì)檢和質(zhì)控結(jié)果 取正常組、模型組、給藥組大鼠的左腦，用Trizol法抽提組織R NA，得到R NA樣品濃度、總量和質(zhì)控瓊脂糖電泳圖，見表1、圖1。18S和28S條帶都很清晰，總R NA吸光度值A(chǔ)260／A280＞1.9，表明得到的高純度總R NA，可以用于后期的基因芯片實(shí)驗(yàn)。

表1 9個樣品O D值、濃度、總量和電泳信息

2.2 紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠MAPK通路的影響 以紅景天苷大鼠芯片陽性表達(dá)基因genesymbol為目錄，輸入京都基因及基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（KEGG）得到其蛋白Pathway通路，見圖2。

2.3 紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠MAPK通路關(guān)鍵基因的影響 以通路中出現(xiàn)的陽性基因?yàn)樾颍业狡鋵?yīng)的基因s y m b l e和注釋，并對其上下調(diào)情況進(jìn)行統(tǒng)計，見表2。

3 討 論

MAPK信號通路是由一組以級聯(lián)方式依次活化的絲／蘇氨酸蛋白激酶組成，每種MAPK被特異的MAPK激酶（MAPKK，ME K）激活，后者又被MAPKK激酶（MAPKKK，ME KK）激活。MAPK信號通路正是通過這種三級酶促級聯(lián)反應(yīng)激活其下游轉(zhuǎn)錄因子，以此將細(xì)胞外信號逐級放大并傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)乃至細(xì)胞核，把膜受體結(jié)合的胞外刺激物與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的效應(yīng)分子連接起來。MAPK是該信號通路的樞紐，激活的MAPK通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄及凋亡調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤及其他多種疾病發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)［5］。本實(shí)驗(yàn)從紅景天苷對MAPK信號通路的基因水平進(jìn)行闡釋，紅景天苷可能是通過影響了MAPK信號通路的相關(guān)基因而產(chǎn)生對局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用，其主要作用靶基因有CACNA1S、CACNB3、CACNG3、DUSP6、FOS、MAPK11、NLK、NR4A1、PRKCB。

表2 紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠MAPK通路的關(guān)鍵基因的影響

［1］全國中草藥編著組 .全國中草藥匯編：下冊［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：273－274.

［2］崔艷梅，婁安如，趙長琦 .紅景天屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，44（3）：328－332.

［3］李丹紅，孟玉彩，趙文 .紅景天植物生物活性研究進(jìn)展［J］.毒理學(xué)雜志，2008，22（4）：320－323.

［4］XU X，CHUA C C，GAO J，et al.Neuroprotective effect of humanin on cerebral ischemia／reperfusion in jury is mediated by a PI3K／Aktpathway［J］.Brain Res，2008，1227：12－18.

［5］莫建文，黃河，張春強(qiáng)，等 .絲裂原活化蛋白激酶信號通道對大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.2007，27（10）：919－921.