Nucleostemin通過p53與非p53途徑調控細胞增殖的研究進展

王　嬌(綜述)，野　娜，韓世愈(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院婦產科，哈爾濱 150001)

Nucleostemin通過p53與非p53途徑調控細胞增殖的研究進展

王嬌△(綜述)，野娜，韓世愈※(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院婦產科，哈爾濱 150001)

摘要：Nucleostemin(NS)是一種可在細胞核仁和核漿內穿梭的GTP結合蛋白，主要定位于核仁內，其在維持干細胞未分化狀態、細胞周期進程、腫瘤細胞及干細胞的增殖與凋亡中發揮著重要作用。就NS調控細胞增殖的機制而言，目前仍存在爭議。一部分研究認為，NS通過結合p53，發揮維持細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用；另一部分研究則認為，NS通過細胞內其他通路及參與核糖體的生物合成，進而影響細胞的生物學功能。

關鍵詞：Nucleostemin; p53途徑; 增殖

Tsai和McKay[1]分離并鑒定出一種已知基因的新克隆，即Nucleostemin(NS)基因。人類的NS基因定位于3p21.1，cDNA全長1650 bp，編碼一個由549個氨基酸殘基組成的分子質量為61 800的蛋白質。結構上，包含有NH2-末端基本結構域(B)、螺旋卷曲結構域(C)、COOH-末端的酸性結構域(A)、兩個GTP結合結構域(G1和G4)以及一個位于G1和A之間的中間結構域(I)。NS在胚胎干細胞[2]、造血干細胞[3]、間充質干細胞[4]等干細胞以及腎癌細胞[5]、胃癌細胞[6]、宮頸癌細胞[7]等腫瘤細胞系中均有表達。近年來的研究證實，NS可影響細胞增殖[1]，但對于NS調控細胞增殖的具體機制尚存在爭議，現對此機制的研究進展進行綜述。

1NS調控細胞增殖概述

NS在細胞增殖的調控中發揮著積極的作用。在分化的神經干細胞中，NS的表達降低，干細胞的增殖能力下降[8]。利用成纖維生長因子2刺激骨髓干細胞增殖后，NS的表達增加[9]。在非洲爪蟾胚胎中，NS在增殖速率高的細胞中優勢表達[10]。同時，NS在大量腫瘤細胞系中高表達，敲除U2OS細胞中NS的表達將導致非循環細胞增多[11]。以上研究證實，NS能夠維持與調控細胞的增殖。NS在正常條件下維持細胞增殖的意義在于，S期基因組復制時，NS轉移到核漿中保護基因組免于DNA損傷。

2010年，Lin等[12]在實驗中發現，高表達NS的小鼠乳腺癌細胞較其他乳腺癌細胞的增殖能力和體內外致瘤性更強。抑制腫瘤細胞株中NS的表達可抑制細胞增殖，在裸鼠體內成瘤實驗中也獲得相同結論[13]。對于NS在細胞增殖過程中的作用，目前有兩種觀點，一種認為：NS通過與p53形成復合物抑制p53的抑癌作用。這種觀點可以解釋抑制腫瘤細胞中NS的表達，導致p53激活，進而誘導p53依賴的細胞周期停滯。另一種觀點強調NS在細胞增殖過程中獨立發揮作用。Beekman等[10]認為，NS缺陷型小鼠胚胎在移植前即發生死亡，而這種發生在胚胎早期的死亡與p53無關。NS不僅在腫瘤細胞以及干細胞中通過p53途徑發揮促增殖作用，同時還可以通過其他途徑調控細胞的增殖，如NS是核糖體生物合成的原件之一[14]，耗盡NS將導致S期細胞的DNA損傷，導致周期停滯，進而引起核糖體變異，影響核糖體的生物合成。

2NS通過p53途徑調控細胞增殖

研究表明，NS通過p53調節細胞增殖過程需要INK4a(inhibitor of CDK4)/ARF(alternative reading frame)[15]。INK4a/ARF是細胞周期抑制蛋白，可以通過MDM2(murine double minute-2)穩定p53。在細胞分化過程中，NS表達減少，INK4a/ARF表達增多，通過p53通路抑制細胞周期進程。當NS表達增多時，S期細胞比率增加，腫瘤生長加速；抑制NS表達時，S期細胞比率降低，G0/G1期細胞比率增加，細胞增殖速度明顯降低[9]。

2009年，Nomura等[16]在實驗中發現，靶向敲除NS基因的小鼠其生長發生停滯，這表明NS在胚胎發育早期發揮著至關重要的作用。為了解NS在胚胎發育過程中的作用，Nomura等[16]構建了NS缺失型胚胎干細胞，通過檢測多能性標志物(oct-3/4)的表達、觀察細胞生長周期等發現，無NS作用的情況下，p53活化增多，進而導致胚胎干細胞以及分化而來的神經干細胞的增殖受抑制，細胞發生凋亡。這一研究進一步說明，NS在胚胎干細胞中是通過p53途徑發揮作用的。

在NS經p53途徑調節細胞增殖的理論被廣泛認可的同時，學者們又開始研究這一理論在臨床中的應用。p53基因功能的改變與腫瘤的發生密切相關，其突變常發生在侵襲性腫瘤中。Ma等[17]對71例腦垂體腺瘤樣本進行分析，分別檢測NS、ASPP2(p53凋亡刺激蛋白基因)以及Ki-67(細胞增殖相關基因)的表達，結果發現，NS與Ki-67的表達水平呈正相關，ASPP2與Ki-67的表達呈負相關，三者的差異表達導致垂體瘤病理類型以及分子生物學特征發生變異。于是作者得出結論：NS、ASPP2以及Ki-67均可作為腦垂體瘤的臨床標志物，同時推測，NS與ASPP2可能是通過與p53相互作用，進而影響腫瘤的增殖和侵襲。2014年，Kobayashi等[18]也得出了類似的結論，該研究對220例手術切除的乳腺癌組織樣本進行組學分析，結果發現，220例標本中有142例NS呈陽性表達，且與p53、雌激素受體及人類表皮生長因子受體2相關。NS陽性患者的生存率明顯低于陰性患者，而NS-/p53-患者的預后最差，NS與p53相互作用影響乳腺癌的進展。Guo等[19]在實驗中發現，對SKBR-3細胞進行RNA干擾，下調其NS的表達，可導致細胞周期停滯在G1期，p53途徑被激活，進而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

3NS通過非p53途徑調控細胞增殖

2013年，Zwolinska等[20]提出了NS作為c-myc原癌基因的轉錄因子直接參與加速細胞增殖與腫瘤發生的過程。首先，其通過Microarray分析方法找到并確認NS是c-myc的保守轉錄因子之一；其次，當NS單倍計量不足時能使小鼠不受myc基因的影響，在體內形成腫瘤，這說明NS在成瘤過程中直接發揮作用。為區分這一過程有無p53的作用，Zwolinska等[21]又檢測了NS(-)穩轉細胞系的細胞生長曲線，發現無論有無p53作用，細胞增殖能力均下降。將NS雜合小鼠與p53(-)小鼠雜交，對其后代研究發現，在無p53作用的情況下，NS(-)小鼠的生存時間明顯高于NS(+)小鼠[21]。以上實驗結果無疑說明NS通過非p53途徑仍可直接影響細胞增殖。

Yoshida等[21]通過研究p21(p53最主要的效應物之一)和p27(細胞周期調節因子)兩種因子表達的改變，闡述了NS是如何通過非p53途徑影響口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖。正常來說，NS下調可導致p21表達增多，激活的p53促使細胞發生轉錄，并抑制細胞周期進程。然而實驗結果卻發現，即使下調了NS的表達，抑制了細胞增殖，p27的表達增多，而p21的表達卻無明顯改變。這表明，NS的促增殖作用不僅僅取決于p53的結合能力，還與p27誘導的細胞周期停滯密切相關。Jafarnejad等[22]也在實驗中得出了類似的結論，其通過RNA干擾降低小鼠骨髓間充質干細胞中NS的表達，檢測細胞周期以及細胞增殖率。結果發現，細胞增殖速度明顯降低，細胞周期蛋白D1和凋亡抑制基因存活蛋白的表達也明顯降低，而p21卻無明顯變化。Lin等[23]認為，NS基因對細胞增殖的調控可能與細胞周期蛋白D1有關。體外酵母雙雜交實驗發現，蛋白磷酸酶2A調節亞基可與NS結合并發揮作用[24]，蛋白磷酸酶2A調節亞基能夠調節蛋白磷酸酶2A的活性，后者能夠改變Axin的磷酸化狀態，抑制β聯蛋白的降解，那么是否可以認為NS通過影響Wnt信號通路影響細胞的增殖分化還需要進一步研究證實。

4小結

以上討論了NS通過p53依賴途徑以及非p53依賴途徑調控細胞增殖機制的最新研究進展。看似矛盾的兩種觀點，其實在某一方面存在著統一。即NS蛋白并非如之前預期的一樣，通過某一條通路調控著細胞周期與細胞增殖，其是一種多任務處理蛋白，通過多種途徑發揮生物學作用。這也進一步印證了任何生物細胞表型的出現均是復雜的分子事件，不能用單一觀念理解。

越來越多的證據證實，NS在腫瘤的形成、細胞增殖、分化、凋亡，甚至是腫瘤的侵襲轉移中發揮著重要作用。2011年的一項研究證實，NS作為一種對氧化還原反應高度敏感的蛋白可增加細胞內活性氧的水平，使NS發生多聚化，進而阻滯其降解，在調節細胞增殖能力的同時，導致了造血系統腫瘤的惡性轉化[25]，這無疑為NS作為部分腫瘤的基因靶向治療提供了有力的證據。相信隨著對NS在細胞增殖及其他領域的研究，將對人類進一步了解腫瘤細胞及干細胞的增殖途徑，以及腫瘤的早期診斷、靶向治療有所助益。

參考文獻

[1]Tsai RY,McKay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells[J].Genes Dev,16(23):2991-3003.

[2]Han C,Zhang X,Xu W,etal.Cloning of the nucleostemin gene and its function in transforming human embryonic bone marrow mesenchymal stem cells into F6 tumor cells[J].Int J Mol Med,2005,16(2):205-213.

[3]Yamashita M,Nitta E,Nagamatsu G,etal.Nucleostemin is indispensable for the maintenance and genetic stability of hematopoietic stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,441(1):196-201.

[4]Zamperone A,Pietronave S,Merlin S,etal.Isolation and characterization of a spontaneously immortalized multipotent mesenchymal cell line derived from mouse subcutaneous adipose tissue[J].Stem Cells Dev,2013,22(21):2873-2884.

[5]Fan Y,Liu Z,Zhao S,etal.Nucleostemin mRNA is expressed in both normal and malignant renal tissues[J].Br J Cancer,2006,94(11):1658-1662.

[6]Liu SJ,Cai ZW,Liu YJ,etal.Role of nucleostemin in growth regulation of gastric cancer,liver cancer and other malignancies[J].World J Gastroenterol,2004,10(9):1246-1249.

[7]Ye F,Zhou C,Cheng Q,etal.Stem-cell-abundant proteins Nanog,Nucleostemin and Musashi1 are highly expressed in malignant cervical epithelial cells[J].BMC Cancer,2008,8:108.

[8]裴方, 王建超, 江紅輝, 等.Nucleostemin在大鼠骨髓基質干細胞向成骨細胞誘導分化中的研究[J].醫學分子生物學雜志, 2010, 7(1): 45-49.

[9]Kafienah W,Mistry S,Williams C,etal.Nucleostemin is a maker of proliferating Stromal Stem Cells in Adult Human Bone Marrow[J].Stem Cells,2006,24(4):1113-1120.

[10]Beekman C,Nichane M,De Clercq S,etal.Evolutionarily conserved role of nucleostemin: controlling proliferation of stem/progenitor cells during early vertebrate development[J].Mol Cell Biol,2006,26(24):9291-9301.

[11]Meng L,Lin T,Tsai RY.Nucleostemin mobilization of nucleostemin stabilizes MDM2 and promotes G2-M progression and cell survival[J].J Cell Sci,2008,121(Pt 24):4037-4046.

[12]Lin T,Meng L,Li Y,etal.Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells[J].Cancer Res,2010,70(22):9444-9452.

[13]Sijin L,Ziwei C,Yajun L,etal.The effect of knocking-down nucleostemin gene expression on the in vitro proliferation and in vivo tumorigenesis of HeLa cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2004,23(3):529-538.

[14]Romanova L,Grand A,Zhang L,etal.Critical role of nucleostemin in pre-rRNA processing[J].J Biol Chem,2009,284(8):4968-

4977.

[15]Ma H,Pederson T.Depletion of the nucleolar protein nucleostemin causes G1 cell cycle arrest via the p53 pathway[J].Mol Biol Cell,2007,18(7):2630-2635.

[16]Nomura J,Maruyama M,Katano M,etal.Differential requirement for nucleostemin in embryonic stem cell and neural stem cell viability[J].Stem Cells,2009,27(5):1066-1076.

[17]Ma L,Chen ZM,Li XY,etal.Nucleostemin and ASPP2 expression is correlated with pituitary adenoma proliferation[J].Oncol Lett,2013,6(5):1313-1318.

[18]Kobayashi T,Masutomi K,Tamura K,etal.Nucleostemin expression in invasive breast cancer[J].BMC Cancer,2014,14:215.

[19]Guo Y,Liao YP,Zhang D,etal.In vitro study of nucleostemin as a potential therapeutic target in human breast carcinoma SKBR-3 cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(5):2291-2295.

[20]Zwolinska AK,Heagle Whiting A,Beekman C,etal.Suppression of Myc oncogenic activity by nucleostemin haploinsufficiency[J].Oncogene,2012,31(28):3311-3321.

[21]Yoshida R,Fujimoto T,Kudoh S,etal.Nucleostemin affects the proliferation but not differentiation of oral squamous cell carcinoma cells[J].Cancer Sci,2011,102(7):1418-1423.

[22]Jafarnejad SM,Mowla SJ,Matin MM.Knocking-down the expression of nucleostemin significantly decreases rate of proliferation of rat bone marrow stromal stem cells in an apparently p53-independent manner[J].Cell Prolif,2008,41(1):28-35.

[23]Lin S,Yu HS.Clinical significance of nucleostemin expression and its correlation with cyclin D1 expression in malignant ovarian tumors[J].Int J Gynecol Cancer,2011,21(7):1166-1171.

[24]Yang HX,Jin GL,Meng L,etal.Screening and identification of proteins interacting with nucleostemin[J].World J Gastroenterol,2005,11(31):4812-4814.

[25]Huang M,Whang P,Chodaparambil JV,etal.Reactive oxygen species regulate nucleostemin oligomerization and protein degradation[J].J Biol Chem,2011,286(13):11035-11046.

Progress of Nucleostemin Regulated Cell Proliferation by p53/non-p53 PathwayWANGJiao,YENa,HANShi-yu.(DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:Nucleostemin(NS) is a GTP-binding protein,shuttling between nucleolus and nucleoplasm,and mainly located in the nucleolus.NS plays an important role in maintaining the undifferentiated state of stem cells,modulating cell cycle and proliferation and apoptosis of several cancer cells and stem cells.But the mechanism involved in regulation of cell proliferation of NS is currently still controversial.Some are convinced that NS promotes cell proliferation and inhibits cell apoptosis combined with p53,another part of the researchers consider non-p53 pathway is the regulatory factor for influencing the cellular functions.

Key words：Nuclestemin； p53 pathway； Proliferation

收稿日期：2014-12-28修回日期：2015-04-28編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.009

中圖分類號：R730.231

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4057-03