腫瘤多藥耐藥性體外模型的方法與評價

喬婷婷(綜述)，彭　芳(審校)

(大理學院藥學與化學學院，云南 大理 671000)

腫瘤多藥耐藥性體外模型的方法與評價

喬婷婷△(綜述)，彭芳※(審校)

(大理學院藥學與化學學院，云南 大理 671000)

摘要：建立優勢腫瘤多藥耐藥性體外模型有助于闡明多藥耐藥的相關機制、優化現有抗腫瘤藥物評價方法，并為腫瘤多藥耐藥逆轉研究以及開發新的抗腫瘤藥物提供參考。該文介紹了腫瘤多藥性體外模型的建立方法，并對藥物大劑量間斷沖擊法、藥物濃度遞增法、大劑量間斷沖擊法結合濃度遞增法以及轉基因法結合藥物等建模方法進行綜合評價。

關鍵詞：腫瘤；多藥耐藥；模型；評價

腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥是當今腫瘤治療的一大難題，據美國癌癥協會估計，>90%的腫瘤患者死于不同程度的耐藥，腫瘤多藥耐藥性(multiple drug resistance，MDR)是腫瘤治療的主要障礙[1]。MDR是指在腫瘤治療中，腫瘤復發后對曾經使用過的有效抗腫瘤藥物以及未曾用過的作用和機制尚不明確的其他抗腫瘤藥物無效[2]。目前對腫瘤耐藥機制的研究已經取得了重要進展[3]。腫瘤細胞膜上P-糖蛋白轉運蛋白的高表達是MDR的主要作用機制之一，該蛋白是膜轉運蛋白家族中的一員[4-6]。建立體外MDR模型是探討體外抗腫瘤方法的一種重要手段[7]。現針對MDR模型的建立方法、特點及檢查指標進行歸納整理，為進一步篩選有效逆轉腫瘤MDR的藥物、提高化療效果提供理論參考。

1腫瘤MDR體外模型的建立方法

在體外建立腫瘤耐藥細胞株至今已有20多年的歷史，目前，建立多藥耐藥細胞株的方法大體可分為：藥物大劑量間斷沖擊法、藥物濃度遞增法、大劑量間斷沖擊結合濃度遞增法、射線照射、基因轉染和轉基因結合藥物篩選法等。其中，藥物大劑量間斷沖擊法和藥物濃度遞增法是體外誘導耐藥細胞株的常用方法[8-9]。

1.1藥物大劑量間斷沖擊法也稱為短時接觸培養法，其是給予細胞較高濃度的抗腫瘤藥物，作用短暫時間后換用不含藥物的培養基讓其繼續生長，換液處理漂浮起來的細胞，當細胞達到一定數量時重復上述方法繼續誘導，由此得到穩定的、具有耐藥性的細胞株[10]。該方法在給藥時間上與臨床化療周期相似，省時方便、不易污染，但可能對細胞造成較大的傷害，且誘導時間長、步驟繁雜，細胞較易死亡[11]。由于其可以提高療效、減少化療藥物帶來的不良反應，該方法常用于臨床。

誘導耐藥的藥物主要有阿霉素、5-氟尿嘧啶、雷替曲塞、順鉑以及紫杉醇等。延冰等[12]給予處于對數期的人胃癌細胞株BGC823大劑量順鉑，誘導形成人胃癌耐藥細胞株BGC823/順鉑。鄭婷婷等[13]采用大劑量阿霉素間歇誘導人乳腺癌細胞MCF-7形成耐藥人乳腺癌細胞模型MCF-7/阿霉素。胡杰等[14]使用高濃度阿霉素對人肝癌細胞株7721進行間歇誘導，經歷21個月后成功培養成7721/阿霉素人肝癌耐藥細胞模型。

1.2藥物濃度梯度遞增法又稱逐步誘導法、小劑量逐步增加劑量持續給藥法。該方法是將化療藥物從低濃度開始，逐漸增加藥物濃度，將腫瘤細胞培養于該培養基中誘導，直至產生耐藥性[15]。楊琰等[16]運用濃度梯度遞增法，采用紫杉醇進行誘導，歷時6個月，成功獲得卵巢癌耐紫杉醇細胞株SKOV3-ts。張福軍等[17]采用順鉑誘導口腔腺樣囊性癌Acc-3細胞成功建立耐藥細胞系Acc-3/順鉑。該方法較常用，建立的細胞系耐藥性穩定、可靠，誘導所需時間短，建立的耐藥細胞株在凍存或撤藥后仍有較高的耐藥性，且耐藥倍數大于大劑量沖擊法，但其建立的耐藥模型的增殖能力較低[18]。

1.3大劑量間斷沖擊法結合濃度遞增法該方法是將以上兩種方法結合起來，其可以很好地模擬臨床上腫瘤出現的多藥耐藥現象。徐小方和曹云新[19]采用濃度梯度遞增法聯合大劑量沖擊誘導人涎腺黏液表皮樣癌細胞株MEC，并成功得到了人涎腺黏液表皮樣癌多藥耐藥細胞系MEC/5-氟尿嘧啶。陸海等[20]使用此方法誘導建立人結腸癌奧沙利鉑多藥耐藥細胞系HCT116/L-OHP。這種方法建立的耐藥株耐藥倍數高于大劑量間歇沖擊法，其穩定性好，但操作步驟復雜、培養時間較長，且劑量大小不易掌握[21]。

1.4化學誘變劑、射線照射化學誘變劑、射線輻射作為誘變劑，可提高基因變異概率，增加細胞誘導成功率，其有助于在短時間內提高對耐藥細胞的篩選，可作為耐藥模型建立的輔助方式。李明耀[22]選取對X線相對敏感的鼻咽癌細胞株CNE-2進行間歇性大劑量γ射線照射，在產生明顯輻射抗拒性的同時，也產生了MDR，獲得了鼻咽癌輻射抗拒細胞株CNE-2R。此方法在卵巢癌、人腦膠質瘤、人喉鱗癌等的治療中發揮著不可替代的作用。

1.5基因轉染該方法是將MDR1基因轉染敏感細胞株，從而獲得耐藥細胞株，此種耐藥表型的特點是耐藥基因型單純、轉染率不高，且在轉染過程中易因新基因的插入引起細胞性狀的改變[23]。

1.6基因轉染和轉基因結合藥物篩選法該方法是近年來新興的一種建立多藥耐藥細胞株的方法，該方法建立模型所用時間短、耐藥性基因型單純、耐受性強、效率高且不易丟失，但技術復雜，要求的設備先進且不能用于多種復雜細胞株的建立，轉染率不高[24]。

2建立模型的檢測指標與評價方法

評價耐藥模型的方法包括：細胞形態學觀察、生長曲線測定、耐藥倍數檢測、耐藥標志物檢測及耐藥機制檢測。

2.1倍增時間測定及細胞形態學觀察陳婕和王家東[24]在建立喉癌耐藥細胞株Hep2/5-氟尿嘧啶的過程中對耐藥細胞的生物學特性進行觀察，觀察耐藥細胞和親本細胞的形態學變化，采用流式細胞術對細胞周期和細胞凋亡率進行檢測，以此判定耐藥細胞是否具有耐藥性。

2.2生長曲線測定王金華等[25]建立人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株OV1228/Taxol后，繪制細胞生長增殖曲線，根據Patterson公式，計算細胞在對數生長期的倍增時間。

2.3耐藥倍數的檢測用一種化療藥物誘導建立的多藥耐藥細胞系一般需要用同種、同類或不同種類的多種化療藥物檢測細胞的敏感性以判定其MDR，耐藥性一般用耐藥倍數表示，實驗常采用四甲基偶氮唑藍法、磺酰羅丹明比色法檢測。四甲基偶氮唑藍法可用于檢測加入不同藥物后耐藥細胞的敏感性和半抑制濃度、交叉耐藥、計算耐藥指數等[26]。檢測細胞內熒光染料羅丹明123的積累變化，可用來對藥物逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的活性進行評價[27]。光學顯微鏡、透射電鏡對細胞形態及超微結構變化的觀察，臺盼藍染色活細胞技術繪制生長曲線計算細胞倍增時間，Patterson法對細胞群體倍增時間計算，Hambur-Salmon法對集落生成率計算[28]，胰酶-姬姆薩G顯帶法進行染色體分析，染色體數平板克隆形成率，以上幾種方法均可用于細胞耐藥倍數的檢測。

2.4耐藥標志物的檢測耐藥標志物包括多藥耐藥蛋白及其他標志性惡性功能分子[29]。常見的耐藥標志物有腫瘤多藥耐藥基因1產生的P糖蛋白[30]、MDR相關蛋白基因、腺苷三磷酸結合轉運蛋白G超家族成員2(該蛋白與P糖蛋白都屬于膜轉運蛋白家族)、多藥耐藥相關蛋白2、Bax蛋白、谷胱甘肽-S-轉移酶、拓撲異構酶Ⅱ、乳腺癌耐藥蛋白以及肺耐藥相關蛋白等。王金華等[25]在人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株 OV1228/Taxol的建立中發現，蛋白激酶C-a可能與腫瘤多藥耐藥基因1的表達相關。常用的檢測耐藥標志物的方法有實時熒光定量聚合酶連反應檢測MDR基因信使RNA的表達，蛋白印跡法檢測P糖蛋白的表達，基因芯片法檢測信號通路的改變。

2.5耐藥機制的檢測MDR已成為腫瘤治療的最大阻礙。腫瘤多藥耐藥機制包括以下幾種：①耐藥相關蛋白高表達，包括P糖蛋白、肺耐藥相關蛋白、乳腺癌耐藥蛋白以及多藥耐藥蛋白；②影響藥物代謝；③影響藥物作用的靶點；④細胞凋亡受抑。其中P糖蛋白與多藥耐藥的產生密切相關，該蛋白具有外排泵功能，其能使細胞內的藥物濃度降低，使細胞毒藥物在細胞內蓄積減少，最終導致抗癌效應喪失，這是耐藥細胞產生耐藥的重要途徑之一。研究發現，凋亡受抑在腫瘤細胞耐藥中有重要作用，其中存活蛋白是主要的凋亡抑制分子，主要表達于人未分化的成熟組織以及多種腫瘤細胞中[30]。腫瘤MDR的產生可能與DNA修復、蛋白激酶C、微管蛋白相關蛋白、體內激素、腫瘤血管形成以及線粒體凋亡方式等多種因素有關[31-32]。

3小結

在體外建立穩定的腫瘤多藥耐藥模型，對研究MDR的機制及逆轉具有重要意義。一直以來，多位學者已成功建立了一系列的多藥耐藥體外模型，這些模型為進一步研究腫瘤耐藥、提高化療效果等奠定了基礎。尋找能有效逆轉MDR的逆轉劑是當前腫瘤化療亟待解決的難題，從天然資源中尋求高效、低毒、作用靶點廣泛的耐藥逆轉劑已成為MDR研究的必然趨勢和熱點，相信在不久的將來研究者能夠克服這些難題，使腫瘤得到很好的治療。

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Methods and Evaluation of in vitro Multi-drug Resistance Tumor ModelQIAOTing-ting，PENGFang.(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity，Dali671000,China)

Abstract:Setting up advantageous multi-drug resistant tumor model in vitro can provide guidance for clarify the multi-resistance related mechanism,and optimize the existing antitumor drug evaluation methods,provide references for reversion of multi-drug resistant tumor and the development of new antitumor drugs.Here introduces the modeling methods of multi-drug resistant tumor in vitro,analyzing and summarizing the intermittent shock method for large dose drug,the method of increasing drug concentration,large doses of discontinuous shock combined with concentration increasing method and genetically modification combined with drug screening method.

Key words:Tumor； Multi-drug resistant； Model； Evaluation

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-03-15編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.023

中圖分類號：R752.11

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4093-03