刺猬信號通路在氟中毒軟骨損害機制中的研究進展

朱志堅，陶　欣(綜述)，于燕妮(審校)

(貴陽醫學院病理學教研室，貴陽 550004)

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刺猬信號通路在氟中毒軟骨損害機制中的研究進展

朱志堅△，陶欣△(綜述)，于燕妮※(審校)

(貴陽醫學院病理學教研室，貴陽 550004)

摘要：氟在生理代謝過程中發揮著不可替代的作用，適量的氟能促進神經系統及運動系統的生長發育，但攝入過多將會引起一系列的中毒癥狀。氟骨癥是一種慢性骨關節病，其主要侵害四肢關節的軟骨、骨及骨周組織。刺猬(Hh)信號通路是一條經典的胚胎發育和分化信號轉導系統，在胚胎發育和細胞分化增殖中起重要作用，且Hh信號通路中的許多因子直接對軟骨及骨的發育起調控作用。因此，Hh信號通路可能參與氟中毒軟骨損害的發病機制。

關鍵詞：地方性氟中毒；Hh信號通路；軟骨損害

地方性氟中毒是指長期生活在高氟地區的居民通過飲水、食物和空氣等方式，使機體攝入過量的氟而導致的一種慢性全身性疾病；主要臨床改變分為骨相損害和非骨相損害，輕度氟骨癥只有患病關節疼痛的癥狀，而重度卻可導致關節畸形，甚至造成肢體殘廢。目前，地氟病的發病機制仍在研究中，近年來有大量學者通過各種信號通路來研究地氟病的發病[1-2]。刺猬(hedgehog，Hh)信號通路基因是一種分節極性基因，是Nusslein-Volhard和Wieschaus[3]在研究果蠅發育時發現的。正常情況下該通路對機體的生命活動起重要調節作用[4-5]。外界刺激引起Hh信號通路的異常激活，參與了多種疾病的發生、發展[6-7]。現就Hh信號通路在氟中毒軟骨損害中的可能機制進行綜述。

1Hh信號通路的主要成分、生物學特性及功能

Hh信號通路由Hh蛋白、靶細胞膜上兩種蛋白受體[修補蛋白受體(patched，Ptc)和七次跨膜蛋白受體(smoothened，Smo)]及三種鋅指轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3組成[8]。在果蠅和其他無脊椎動物中只有1種Hh基因，而在哺乳動物中存在3種同源基因，即音速刺猬因子(sonic hedgehog，Shh)、印度刺猬因子(indian hedgehog，Ihh)及沙漠刺猬因子(desert hedgehog，Dhh)，編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。這三類蛋白均由N末端結構域和C端結構域構成，在N端結構域端存在Hh蛋白的活性信號，而C端結構域端則具有自身蛋白水解酶活性和膽固醇酰基轉移酶功能。在一定條件下，這3種Hh蛋白可相互代替，但它們均具有自己獨特的生理功能：Shh作為細胞內信號分子，在Hh信號轉導過程中起主導作用，決定早期肢體的前后生長及體部左右對稱模式；Ihh在軟骨及成骨細胞的分化過程中起調節作用；Dhh在外周神經系統的發育及生殖細胞的產生遷移中起調控作用[9]。Shh、Ihh和Dhh蛋白均為Hh前體蛋白，本身不具有信號轉導活性，只有經過棕櫚酰化后才能獲得活性。Hh信號通路的傳遞受靶細胞膜上Ptc和Smo兩種蛋白受體控制，Ptc蛋白由腫瘤抑制基因Patched編碼，由12個跨膜區的單鏈構成，能與配體直接結合，在哺乳動物中存在Ptch1和Ptch2兩種基因，Ptch1基因可對Hh信號起負調控作用，而Ptch2基因的轉錄可以不依賴于Hh信號通路[10]；Smo蛋白由原癌基因Smothened編碼，由7個跨膜區的單鏈構成，其N端位于細胞外，C端位于細胞內，該蛋白只有當維持全長時才具有啟動下游靶基因的功能，當被蛋白酶水解時，該蛋白可形成轉錄抑制子，抑制下游因子轉錄[11]。Hh信號通路轉導的核心部位是含鋅指結構，包括Gli1、Gli2和Gli3三個成員，其中，Gli1具有轉錄激活作用，且激活后的Gli1可通過正反饋加強Gli1的活化[12]；Gli2、Gli3蛋白均存在兩個功能區域，即C端的激活區域和N端的抑制區域，此兩區域的功能復雜，可在不同的環境中對Hh起激活或抑制作用[13]。研究發現，Smo是Hh信號傳遞所必需的受體，當Hh蛋白缺乏時，Smo蛋白與Ptc結合，從而抑制Smo的活性，使下游Gli蛋白在蛋白激酶A的作用下發生磷酸化，并在蛋白酶體內將Gli蛋白截剪成小片段，使Gli以小片段的形式進入細胞核內，從而抑制下游目的基因的轉錄；當Hh蛋白存在時，Ptc與Hh結合，從而解除對Smo的抑制作用，促使Gli蛋白復合物與微管形成，使得Gli蛋白以全長形式進入核內，進而激活下游目的基因轉錄[12]。下游靶基因包括纖維生長因子、骨形成蛋白、胰島素樣生長因子2、抗凋亡蛋白Bcl-2、細胞周期蛋白D1及Hh相互作用蛋白等[14]。研究發現，Hh信號通路能被一些小分子物質(如：5E1、環杷明、GDC-0449等)特異性地抑制，這些小分子物質可通過阻斷Hh與Ptch和(或)Smo的結合，從而阻斷Hh信號通路的轉導[14,16]。

2Hh對軟骨細胞的作用

Hh信號對軟骨細胞的生長發育起重要調節作用。研究發現，去除Smo因子的軟骨細胞增殖速度明顯降低，相反，上調Smo的表達則可促進軟骨細胞增殖[16]。Shh對軟骨細胞的功能意見不一，有學者認為Shh不僅能促進軟骨間充質細胞和前軟骨細胞向軟骨細胞分化，也能抑制體外培養的軟骨細胞肥大成熟[17]；但也有學者發現，在軟骨細胞生長的早期階段Shh表達量低，而到了軟骨細胞成熟階段Shh表達卻增加，因此認為Shh具有促進軟骨細胞成熟肥大的功能[18]。還有學者發現，在軟骨分化晚期可由骨形成蛋白進行特異性調節[19]。在膝關節骨關節炎的患者中，Ihh蛋白及信使RNA的表達量較正常組高，且隨著軟骨破壞度加重，Ihh蛋白及信使RNA的表達量進一步增加[20]。在膝關節炎大鼠模型中，Gli1、Ptch、Hh相互作用蛋白的表達量增加，而當Smo基因被沉默或使用Hh特異性抑制劑處理時，膝關節骨關節炎的嚴重程度減輕[21]。張杰等[22]的研究證明，漸進性咬合紊亂促進了大鼠髁突軟骨中Ihh及其受體Smo的高表達，而對Ptchl的表達差異無統計學意義。Campbell等[23]研究發現，在軟骨肉瘤中Smo蛋白高表達，而使用Smo抑制劑(PI-926)降低Smo蛋白表達可明顯抑制肉瘤的增長。這些研究成果均表明Hh信號通路不僅可調節軟骨細胞的生長、發育，還可參與軟骨病變的發生、發展。

3Hh信號通路在氟中毒軟骨損傷中的可能機制

3.1氟對軟骨細胞的影響研究發現，氟是參與膠原代謝密切的微量元素，機體攝入過量的氟能導致膠原代謝異常，而膠原蛋白是軟骨組織重要的成分之一，因此氟中毒時可影響軟骨代謝[24-26]。在低劑量氟時，可發現雙核的軟骨細胞數量增多，細胞內線粒體內質網肥大，這些改變使軟骨細胞的代謝功能增強，以促進細胞的增殖；而在高劑量氟時，卻可引起軟骨細胞核固縮凝聚成塊狀聚集在核膜周邊，線粒體內質網電子致密物下降，使其發生退行性變和髓樣變，并有凋亡細胞的出現[27]。氟不僅可引起軟骨細胞細微結構的改變，還可引起軟骨組織的病理損害，表現為骺和關節軟骨深層的肥大軟骨細胞數量增多，預備鈣化層不能鈣化；增厚的骺板軟骨細胞柱排列不整，干骺端血管侵入受阻，使關節軟骨細胞缺血壞死[28]。有研究者發現，小鼠飲用含高濃度氟化鈉的自來水后，軟骨基質內出現大小不均、方向不一的圓形或橢圓形裂隙，軟骨細胞層次排列不清，細胞數量減少，軟骨層變薄，骨小梁增寬，并可出現軟骨細胞的部分壞死，提示氟中毒時軟骨可出現不同程度的骨化，具有硬化性氟骨癥的病理改變[29]。目前，大多數學者認為氟誘導的氧自由基學說及細胞凋亡學說是研究氟中毒發病機制的經典學說。

3.2Hh信號通路與氟中毒氧自由基水平升高對軟骨的影響在正常情況下，活性氧自由基可由細胞代謝不斷產生與清除，兩者處于動態平衡狀態。當活性氧自由基產生超過機體防御體系的清除能力或機體的防御體系不能正常發揮功能時，體內氧自由基代謝就會出現失衡，即氧化應激。氟是一種化學性質極為活潑的元素，具有較強誘導脂質過氧化的能力。氟中毒時，氟離子與抗氧化酶的活化中心結合，使抗氧化酶(如谷胱甘肽S轉移酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等)活性下降，而活性氧自由基及脂質過氧化物等指標水平升高，導致機體氧化與抗氧化失衡，造成細胞損傷[30]。研究發現，用不同濃度的氟處理體外培養的軟骨細胞后，在培養基中過氧化氫及一氧化氮水平隨氟濃度的增加而增加，而使用超氧化物歧化酶處理后，培養基中的氧自由基水平降低，表明氟可促進軟骨細胞氧自由基的產生，而超氧化物歧化酶可減少或抑制氧自由基的產生[31]。并且，在氧自由基作用下，軟骨細胞柱出現長度增加及橫徑變短等病理改變，說明氟引起軟骨細胞損害與氧化應激反應有關；軟骨細胞在氧自由基作用下還可使其分泌的Ⅱ型膠原轉變為Ⅰ型膠原，導致軟骨細胞分化的異常[32]。研究表明，Hh信號通路與氧化應激有著密切的聯系，機體發生氧化應激損傷時可刺激Shh的釋放；同時，氧化應激與Shh可發揮協同作用，共同調節谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛、Bcl-2和超氧化物歧化酶等的表達；且激活的Shh還可抑制Bax的表達，而促進Bcl-2的表達[33-34]。但也有研究發現，在體外培養的乳鼠心肌細胞給予氧化應激系統刺激后，Shh蛋白及信使RNA的表達下降，當使用維生素C和維生素E處理后，Shh蛋白及信使RNA的表達出現逆轉，提示了氧化應激會引起Shh表達下降；研究還發現，氧化應激誘導機體分泌的Shh可利用Hh信號通路對星形細胞起到保護作用[35]。此結果均提示Hh信號通路可能參與氧自由基對軟骨細胞損害作用。

3.3Hh信號通路與氟中毒凋亡對軟骨的影響細胞凋亡是一種基因調控的程序性細胞死亡方式，具有特征性形態和生化改變。凋亡的發生受到多種基因嚴格控制，包括胱天蛋白酶(caspase)家族、Bcl-2家族、癌基因(如c-myc、p53)和抑癌基因等。當氟中毒時，過量氟引起自由基升高可直接作用于核酸，引起堿基修飾甚至DNA鏈的斷裂，進而引起聚腺苷二磷酸核酸轉移酶的活化和p53的積累，引起細胞凋亡；同時，氟造成細胞膜通透的改變使細胞質中鈣離子濃度增高，使鈣依賴caspase活性升高，進而破壞細胞骨架，使細胞發生凋亡；并且，過量氟化物刺激體內一氧化氮合酶的表達，造成一氧化氮產生過量，過量的一氧化氮激活促凋亡因子Bax，Bax引起線粒體釋放細胞色素C，而釋放的細胞色素C又可與凋亡蛋白激活子1結合，進而激活啟動型caspase(caspase-9)及執行型caspase(caspase-3)，而caspase-3通過剪切蛋白后可進入細胞核降解DNA鏈，導致細胞凋亡[36]。研究表明，許多參與細胞增殖、凋亡的效應分子(如細胞周期蛋白D、細胞周期蛋白E、細胞周期蛋白B、Bcl-2、c-myc)被證明是Hh信號通路的下游分子[37]，因此Hh信號通路可利用這些分子對細胞的增殖及凋亡發揮調控作用。有報道，Gli3水解后可抑制Bcl-2啟動子，促進凋亡[38]；但也有研究發現，Bcl-2的順式調控區存在3個Gli2的結合位點，這些位點可被Gli2識別，進而選擇性地激活人類Bcl-2的啟動子，促進Bcl-2的表達，以抑制細胞凋亡[39]。研究者通過RNA干擾技術對人食管癌細胞Smo因子沉默后，發現細胞的凋亡率明顯升高，此外還發現Shh可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶信號和穩定Bcl-2、Bcl-xL來保護胰腺導管細胞免受凋亡[40]。此結果均提示Hh信號通路對細胞的凋亡可起調控作用。

此外，Hh信號通路與Wnt、Ras、絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶等信號通路發生交聯，使Hh通路的調節和作用復雜化[41]，而這些信號通路均被證明參與了氟中毒的發病機制[42-43]。Hh信號通路與這些信號通路、細胞凋亡以及氧化應激之間的聯系密切，可能共同參與了地方性氟中毒軟骨損害的發病機制。

4小結

氟中毒時對軟骨細胞有嚴重的損害作用，可引起軟骨細胞的凋亡、壞死及分化異常，造成軟骨層變薄、軟骨骨化等病理改變，而軟骨損害是導致關節活動障礙、影響患者日常生活的主要原因。氟骨癥的發生可能與過量氟造成機體氧自由基、一氧化氮水平升高及過度激活信號通路有關。通過對氟中毒發病機制的深入探討，將對預防氟中毒的發生、發展及提高患者的生存質量起到極其重要的作用。

參考文獻

[1]Chattopadhyay A，Podder S，Agarwal S，etal.Fluoride-induced histopathology and synthesis of stress protein in liver and kidney of mice[J].Arch Toxicol，2011，85(4)：327-335.

[2]Gutierrez-Salinas J，Morales-Gonzalez JA,Madrigal-Santillan E,etal.Exposure to sodium fluoride produces signs of apoptosis in rat leukocytes[J].Int J Mol Sci,2010,11(9):3610-3622.

[3]Nusslein-Volhard C，Wieschaus E.Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila[J].Nature，1980，287(5785)：795-801.

[4]Xie G，Choi SS，Syn WK，etal.Hedgehog signalling regulates liver sinusoidal endothelial cell capillarisation[J].Gut，2013，62(2)：299-309.

[5]Raju GP.Arsenic:a potentially useful poison for Hedgehog-driven cancers[J].J Clin Invest,2011,121(1):14-16.

[6]Niu Y，Li F，Tang B，etal.Clinicopathological correlation and prognostic significance of sonic hedgehog protein overexpression in human gastric cancer[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7(8)：5144-5153.

[7]Huang Y，Zhang P，Zheng S，etal.Hypermethylation of SHH in the pathogenesis of congenital anorectal malformations[J].J Pediatr Surg，2014，49(9)：1400-1404.

[8]Wang Y，Han C，Lu L，etal.Hedgehog signaling pathway regulates autophagy in human hepatocellular carcinoma cells[J].Hepatology，2013，58(3)：995-1010.

[9]McMahon AP，Ingham PW，Tabin CJ.Developmental roles and clinical significance of hedgehog signaling[J].Curr Top Dev Biol，2003，53：1-114.

[10]Chen Y,Struhl G.Dual roles for patched in sequestering and transducing Hedgehog[J].Cell,1996,87 (3):553-563.

[11]Ruat M，Roudaut H，Ferent J，et al.Hedgehog trafficking，cilia and brain functions[J].Differentiation，2012，83(2)：S97-104．

[12]Hui CC，Angers S.Gli proteins in development and disease[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2011，27：513-537.

[13]Mullor JL，Sanchez P，Ruizi Altaba A.Pathways and consequences:Hedgehog signaling in human disease[J].Trends Cell Biol，2002，12(12)：562-569.

[14]Chaudary N，Pintilie M，Hedley D，etal.Hedgehog pathway signaling in cervical carcinoma and outcome after chemoradiation[J].Cancer，2012，118(12)：3105-3115.

[15]Wang S，Lee Y，Kim J，etal.Potential role of hedgehog pathway in liver response to radiation[J].PLoS One，2013，8 (9)：e74141.

[16]Long F，Zhang XM，Karp S，etal.Genetic manipulation of hedgehog signaling in the endochondral skeleton reveals a direct role in the regulation of chondrocyte proliferation[J].Development，2001，128(24)：5099-5108.

[17]Enomoto-Iwamoto M，Nakamura T，Aikawa T，etal.Hedgehog protein stimulate chondrogenic cell differentiation and cartilage formation[J].J Bone Miner Res，2000， 15(9)：1659-1668.

[18]Wu LN，Lu M，Genge BR，etal.Discovery of sonic hedgehog expression in postnatal growth plate chondrocytes:differential regulation of sonic and Indian hedgehog by retinoic acid[J].J Cell Biochem，2002，87(2)：173-187.

[19]Gofflot F，Hars C，Illien F，etal.Molecular mechanisms underlying limb anomalies associated with cholesterol deficiency during gestation：implications of Hedgehog signaling[J].Hum Mol Genet，2003，12(10)：1187-1198.

[20]楊正青，宋麗琴.印度刺猬蛋白與人膝關節骨關節炎軟骨破壞度的關系[J].中華醫學雜志，2014，94(31)：2434-2437.

[21]Lin AC，Seeto BL，Bartoszko JM，etal.Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis[J].Nat Med，2009，15(12)：1421-1425.

[22]張杰，劉建林，匡斌，等.漸進性咬合紊亂大鼠的髁突軟骨中Ihh、Smo及Ptch1表達變化[J].中華口腔醫學研究雜志，2014，8(3)：14-17.

[23]Campbell VT，Nadesan P，Ali SA，et al.Hedgehog pathway inhibition in chondrosarcoma using the smoothened inhibitor IPI-926 directly inhibits sarcoma cell growth [J].Mol Cancer Ther，2014，13(5)：1259-1269.

[24]Nishida T，Kubota S，Aoyama E，etal.Impaired glycolytic metabolism causes chondrocyte hypertrophy-like changes via promotion of phospho-Smad1/5/8 translocation into nucleus[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21(5)：700-709.

[25]張鐵山，王文波，宋玉文，等.氟對軟骨細胞凋亡因子bcl-2和Bax蛋白表達的影響[J].中國地方病學雜志，2011，30(2)：130-133.

[26]潘磊磊，何楊，吳思思，等.氟中毒大鼠生長板Ihh、PTHrP mRNA 及蛋白表達的變化[J].中國工業醫學雜志，2013，26(4)：253-255.

[27]Meng H，Zhang T，Liu W，etal.Sodium fluoride induces apoptosis through the downregulation of hypoxia-inducible factor-1α in primary cultured rat chondrocytes [J].Int J Mol Med，2014，33(2)：351-358.

[28]劉璐，張穎，顧何鋒，等.過量氟致骨相損傷的早期診斷指標分析[J].山東醫藥，2013，53(42)：5-8.

[29]唐莉，白生賓，張亞樓，等.慢性氟中毒大鼠軟骨的損害及COLIXA3蛋白表達的實驗研究[J].中國地方病學雜志，2011，30(4)：389-392.

[30]Barbier O，Arreola-Mendoza L，Del Razo LM.Molecular mechanisms of fluoride toxicity[J]. Chem Biol Interact，2010，188(2)：319-333.

[31]桂傳枝，王長松，于燕妮，等.氟對體外培養軟骨生長和凋亡的影響及SOD對氟的拮抗作用[J].貴州醫藥，2004,28(4):291-292.

[32]張鍵英，許善錦，王夔．自由基在大骨節病病理過程中的作用[J]．北京醫科大學學報，1991，23(3)：231-233.

[33]Fitch PM，Howie SE，Wallace WA，etal.Oxidative damage and TGF-βdifferentially induce lung epithelial cell sonic hedgehog and tenascin-C expression:implications for the regulation of lung remodelling in idiopathic interstitial lung disease[J].Int J Exp Pathol，2011，92(1)：8-17.

[34]萬曉軍，任鵬，孫發，等.TGF-β1氟中毒大鼠腎臟的表達及意義[J].吉林醫學，2012，33(25)：5386-5389.

[35]Xia YP，Dai RL，Li YN，etal.The protective effect of sonic hedgehog is mediated by the phosphoinositide[corrected]3-kinase/AKT/Bcl-2 pathway in cultured rat astrocytes under oxidative stress[J].Neuroscience，2012，209:1-11.

[36]嚴玉霖,彭恪,高洪.NO對細胞凋亡的影響[J].動物科學與動物醫學,2002,19(6):23-26.

[37]Kasper M，Schnidar H，Neill GW，etal.Selective modulation of Hedgehog/GLI target gene expression by epidermal growth factor signaling in human keratinocytes [J].Mol Cell Biol，2006，26(16)：6283-6299.

[38]王琪琳，蘇林，劉相國.Hedgehog信號通路與腫瘤[J].生命的化學，2011，31(1)：21-26.

[39]Regl G，Kasper M，Schnidar H，etal.Activation of the BCL2 promoter in response to Hedgehog/GLI signal transduction is predominantly mediated by GLI2[J].Cancer Res，2004，64(21)：7724-7731.

[40]Dai RL，Zhu SY，Xia YP，etal.Sonic hedgehog protects cortical neurons against oxidative stress[J].Neurochem Res，2011，36(1)：67-75.

[41]Yanai K，Nakamura M，Akiyoshi T，etal.Crosstalk of hedgehog and Wnt pathways in gastric cancer[J].Cancer Lett，2008，263(1)：145-156.

[42]于燕妮，楊丹，朱海振，等.慢性氟中毒大鼠p38、成骨相關轉錄因子磷脂酰肌醇激酶、Aktl的表達與骨組織的損傷[J].中華病理學雜志，2012，41(9)：622-626.

[43]郭曉東，楊茂偉，梁單，等.氟通過胞外信號調控激酶通路對成骨細胞增殖作用的影響[J].中國地方病學雜志，2012，31(2)：140-143.

Research the Mechanism of Hedgehog Signaling Pathway in Chondrocyte Damage in Endemic FluorosisZHUZhi-jian,TAOXin,YUYan-ni.(DepartmentofPathology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China)

Abstract：Fluorine plays an irreplaceable role in the process of physiological metabolism:appropriate amount of fluoride can promote development of the nervous system and motor system,but excessive intake will cause a series of poisoning symptoms. Skeletal fluorosis is a kind of chronic joint disease,which mainly damages the limb joint cartilage,bone and bone tissues. Hedgehog(Hh) signal pathway is a classic signal pathway of embryonic development and differentiation,which plays an important role in cell differentiation and proliferation during the embryonic development.And many factors of the Hh signaling pathway have direct regulatory role on the growth of cartilage and bone.Therefore, the Hh signaling pathway may be involved in the pathogenesis of cartilage damage in fluorosis.

Key words：Endemic fluorosis； Hh signal pathway； Chondrocyte damage

收稿日期：2015-06-04修回日期：2015-06-30編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學基金(81260419)；教育部博士點基金(博導類)(20125215110001)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.011

中圖分類號：R363.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3294-03