改進的EBSS培養液與常用商品化試劑對鼠胚體外發育的影響

饒金鵬，金敏，金帆

1.浙江大學醫學院附屬第二醫院生殖醫學中心，浙江杭州 310052；2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院，浙江杭州 310006

在體外環境中，胚胎自身不具備任何屏障和保護功能，溫度，濕度，塵埃，揮發性有機物（VOC），振動，噪音，光照等因素都會削弱胚胎的發育潛能[1]。而在諸多影響因素中，培養液是直接同胚胎接觸的最常用也是最重要的消耗品，其性質直接決定著胚胎培養的結局[1-2]。小鼠胚胎生物學檢測（mouse embryo assay,EMA）作為實驗室質量控制（quality control,QC）的常規方法，在評估IVF 實驗室培養液質量方面得到了廣泛的應用[3]。旨在對新建IVF 胚胎實驗室進行質量控制，同時探索胚胎培養液的性質，該院生殖中心對簡單培養液EBSS 進行了一定的改進，并在2014年9月—2015年1月期間，將其應用于鼠胚的體外培養，并與改進前的EBSS 和另外兩種商品化序貫培養液在4 細胞胚胎，8 細胞胚胎，融合胚以及囊胚形成率上進行了對比分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 7 周齡雌性昆明系小白鼠（體質量30～35 g），10周齡雄性小鼠（體質量35～40 g），均購自浙江中醫藥大學實驗動物中心，雌雄分籠飼養。

1.1.2 藥物與試劑尿 促性素（HCG）與絨促性素（HMG）均購自麗珠制藥廠。簡單培養液EBSS 以及丙酮酸鈉，乳酸鈉及11 種氨基酸均購自SIGMA 公司，序貫培養液G1 和G2 以及配子處理液G-GAMETE 購自Vitrolife 公司，序貫培養液Quinn’s1026 和Quinn’s1029，人血清白蛋白（HSA）以及石蠟油均購自SAGE 公司。培養液均添加10%HSA，表面覆油后置于37 ℃,6.0%培養箱中平衡過夜。

1.2 實驗方法

1.2.1 改進的EBSS 培養液的配制 卵裂培養液：向EBSS 中加入丙酮酸鈉并使其濃度達到0.4 mmol/L，加入乳酸鈉并使其濃度達到7 mmol/L，以及丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，絲氨酸等5 種非必需氨基酸并使其濃度均達到0.1 mmol/L；囊胚培養液：調節乳酸鈉濃度至5 mmol/L，加入丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，絲氨酸等5 種非必需氨基酸并使其濃度均達到0.1 mmol/L（同卵裂培養液），加入精氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，纈氨酸等6 種必須氨基酸并使其濃度達到0.25 mmol/L。

1.2.2 鼠胚獲取與培養 雌鼠腹腔注射10 IU 的HMG，48 h 后再注射HCG，注射后立即將雌雄按1:1 的比例合籠，48 h 后取胚。將孕鼠頸椎脫臼處死后用眼科剪取輸卵管放于覆油的G-GAMETE 配子處理液中，用1 mL 注射器針頭將輸卵管切割數次，擠出胚胎，再用拉細的巴斯德管將2 細胞鼠胚收集并隨機分裝到覆油的4 種不同培養液中，并置于培養箱中培養。當胚胎培養到8 細胞階段，A 組將胚胎轉移到新配制并于前1 d 過夜平衡后的EBSS 培養液，B，C,D 3 組分別將胚胎從卵裂培養液轉移到經過夜平衡的囊胚培養液中繼續培養。

1.2.3 鼠胚的觀察 觀察并記錄24 h 后4 細胞胚胎形成率，48 h后8 細胞或融合胚形成率，72 h 后囊胚形成率。

1.3 統計方法

用SPSS 19.0 分析軟件對所得計數數據進行χ2檢驗。

2 結果

在2014年9月—2015年1月期間，該院新建IVF 胚胎實驗室共進行11 個周期的鼠胚體外培養實驗，累計獲取2 細胞胚胎870 枚，其中形成囊胚共614 枚，總體囊胚形成率為70.57%。鼠胚培養分成4 個組別進行，B，C，D 3 組的囊胚形成率顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.001)，4 個組別的胚胎發育情況及囊胚形成率詳見表1。鼠胚于覆油35 mm 皿中體外培養不同時期的生長情況見圖1。

表1 鼠胚在4 個組別不同培養液中不同階段的發育情況

圖1 2-細胞鼠胚于覆油35 mm 皿中體外培養不同時期的生長情況圖

3 討論

嚴格的實驗室質量控制與質量保障系統為胚胎的生長發育提供相對穩定的場所，建立穩定可靠的IVF 實驗室對于最大限度地維持胚胎發育潛能，維持IVF 成功率具有重要的作用[1]。在體內，胚胎的外環境是輸卵管液和子宮分泌液，而在體外，胚胎的環境即是與其直接接觸的培養液?？梢哉f，培養液的組分種類，組分含量和含量比，pH，滲透壓等直接決定了胚胎培養的結局[4]。為了檢測新建IVF 胚胎培養室是否達到人類胚胎培養標準，同時探索是否存在一種更加經濟的培養液同樣能達到與常用商品化試劑相同或相近的胚胎培養效果，該院生殖中心對EBSS 進行了改進，并與其他兩種商品化培養液一起對昆明系小鼠胚胎進行體外囊胚培養實驗。

通過對比簡單培養液EBSS 與兩種商品化序貫培養液的組成成分[1，5]，該研究發現簡單培養液EBSS 在無機鹽離子組分與濃度上與商品化培養液G1/G2，Quinn’s1026/Quinn’s1029 大 致 相同，說明3 種培養液都能對細胞內的離子水平進行調節，以維持胚胎外環境滲透壓的穩定。但在胚胎發育所必需的能量物質方面，簡單培養液EBSS 僅含有葡萄糖及低濃度的丙酮酸鈉。由于處于早期分裂階段的胚胎代謝活動相對較弱，細胞的氧化及生物合成水平較低，故不能很好地利用葡萄糖，而只能利用丙酮酸和乳酸作為能量來源[6]，這也導致了僅以EBSS 作為培養液的大部分小鼠胚胎發育均阻止在2 細胞階段 （103 枚2 細胞中有71枚發育停滯，卵裂率僅為31.07%）。而簡單培養液EBSS 的另外一個不足之處是其不含氨基酸等復合成分。盡管有證據表明，人胚胎可以在缺少氨基酸的培養環境中生長[7]，但氨基酸具有作為蛋白質類物質生物合成前體，能量來源，參與調節胚胎能量代謝，調節滲透壓，調節pH，抗氧化，信息傳遞，調節胚胎分化和參與胚胎細胞基因表達等多種生物學功能[8-10]。而相關研究表明，在8 細胞期前，輸卵管中非必需氨基酸濃度最高，胚胎也主要消耗此類氨基酸，而在8 細胞期后必須氨基酸則能刺激內細胞團的發育[11]，故胚胎在此階段則同時利用非必需氨基酸和必須氨基酸?？紤]到早期胚胎能量物質及氨基酸在胚胎發育中的重要作用，再參照G1/G2 和Quinn’s1026/Quinn’s1029 的組分情況，我們對EBSS 進行了必要的改進（參見實驗方法1.2.1）。

鼠胚體外發育的結果顯示，改進的EBSS 克服了2 細胞阻滯，在所獲得的198 枚2 細胞中，有177 枚發育到4-5 細胞階段，卵裂率為89.39%遠高于未經改進的EBSS 31.07%，而在加入乳酸鈉和11 種氨基酸改進成囊胚培養液后，其囊胚形成率72.22%也遠高于改進前的26.21%，這一結果與美國梅奧醫學中心的Morbeck 等最近在Fertility and Sterility 的研究報告顯示的用SAGE系列序貫培養液的鼠胚囊胚形成率75%，以及用Vitrolife 系列序貫培養液的培養結果78%相近[5]，而由于通過改進后的EBSS 在成本上較之其他商品化培養液有大幅度的降低，說明其更經濟，在鼠胚體外培養上具有更好的實用價值。

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