大鼠骨髓間質干細胞的體外分離培養與鑒定

張愛霞

1.嘉應學院生命科學學院，廣東梅州 514015； 2.中山大學中山醫學院干細胞與組織工程中心，廣東中山 510080

BMSCs 作為多能干細胞的一種，由于其取材方便，具有多向分化潛能，有較弱的免疫抗原性，體內植入反應較弱，正逐漸受到學者們的廣泛關注。BMSCs 不僅可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等[1-2]中胚層來源的細胞，它還具有強大的橫向分化潛能，除了向間質組織分化外，BMSCs 還可跨越胚層限制向外胚層的神經元、神經膠質細胞等外胚層分化，向胰島樣細胞、肝細胞等內胚層來源的細胞分化。BMSCs 的細胞增殖分裂模式使外源基因易于導入和表達，BMSCs 已成為重要的再生醫學種子細胞[3-4]，具有重要的臨床應用前景。

體外成功分離培養BMSCs 是實驗研究和臨床應用的重要前提。該實驗應用全骨髓貼壁培養法分離培養大鼠BMSCs，并觀察其生物學特性及成骨和成脂的分化潛能，為BMSCs 的體內外研究應用奠定基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

4~6周齡SPF 級SD 大鼠，雌雄不限，體重100~150 g，購自中山大學中山醫學院實驗動物中心。

1.2 實驗試劑

L-DMEM 培養基、H-DMEM 培養基均購自美國GIBCO BRL公司；胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶均購自Hyclone 公司；Vitamin C、 地塞米松、 牛胰島素均購自Sigma 公司；β-甘油磷酸鈉購自Calbiochem 公司。兔抗大鼠單克隆抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD45- PE-Cy5 購自BD phamingen 公司。

1.3 大鼠BMSCs 的體外分離、培養與純化

取SPF 級3～4 周齡SD 大鼠，斷頸處死，75%酒精浸泡5 min。無菌條件下分離大鼠雙側股骨，并徹底清除附著其上的肌肉組織，去除兩端骨骺，用含10%胎牛血清的L-DMEM 間質干細胞培養液反復沖洗骨髓腔，收集細胞，1 100 r/min 離心5 min, 棄去上清及脂肪層。以2×105 cells/cm2的密度接種于培養瓶中，置于培養箱中培養。培養48 h 后首次換液，以后每3 d 換液1 次，每天觀察細胞的形態及生長情況。

1.4 流式細胞儀檢測細胞表面標記

收集第3 代細胞，調整細胞密度為1.0×106個/mL，裝入1.5 mL的EP 管中，每管1 mL，1100 r/min 離心4 min，棄上清。每管加入100 μL PBS，混勻，分別加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5兔抗大鼠單克隆抗體1 μL（0.5~1 μg/106 細胞），混勻。37 ℃避光孵育20 min 后，每管加入1 mL PBS，1100 r/min 離心4 min，棄上清，再重復洗2 遍，以除去未結合抗體。0.5 mL PBS 重懸細胞，流式細胞儀進行檢測分析。同時每管樣品設立同型陰性對照。

1.5 體外誘導大鼠BMSCs 成骨和成脂分化

1.5.1 成脂分化及油紅O 染色鑒定 取第3 代的大鼠BMSCs 接種于六孔板，加入含1 umol/L 的地塞米松，0.5 mmol/L 的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 mg/L 的牛胰島素，100 mmol/L 的消炎痛(indomethncin)，10%FCS 的H-DMEM 誘導3 d，再用含10 mg/L的牛胰島素，10%FCS 的H-DMEM 處理1 d，鏡下觀察細胞形態的變化和生長情況。成脂誘導后的細胞用PBS 洗滌3 次，10%多聚甲醛固定10 min，油紅O 染色5~10 min，60%異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗，Mayer 氏蘇木素淺染核，1%鹽酸水稍分化，水漂洗10 min。于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.5.2 成骨分化及茜素紅S 染色 取第3 代的大鼠BMSCs 接種于六孔板，加入成骨細胞誘導液 （含10~7 mol/L 地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 g/mLVitamin C）2 mL，置培養箱中培養。誘導分化18 d 后，吸去成骨細胞誘導液，用PBS 洗滌3 次，然后加入適量的茜素紅-S 染液染10~15 min，顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 BMSCs 的形態學觀察

原代培養時，骨髓細胞接種于培養瓶后，細胞呈圓型，懸浮于培養液中。培養24 h 后即有細胞貼壁，換液后可見短梭形、星形細胞分散貼壁生長，第4～5 d 可形成分散的細胞集落，細胞形態不一，梭形細胞為主，見圖1A。第8～9 d 細胞呈集落生長，細胞間相互緊密貼附生長，沿胞體長軸有序排列，呈螺旋狀或漩渦狀，可達80%~90%融合，見圖1B。消化傳代后，傳代細胞12 h 完全貼壁生長，3～4 d 可傳代1 次。傳代至第3 代的細胞形態均一，呈梭形生長，見圖1C。

圖1 不同時期骨髓間質干細胞的形態學觀察（×100）

2.2 BMSCs 表面標記物的表達

流式細胞儀檢測結果顯示，培養的第3 代大鼠BMSCs CD29、CD44 表達陽性，而CD45 呈陰性，見圖2。

圖2 大鼠骨髓間充質干細胞表面標志物的表達

2.3 BMSCs 成脂成骨誘導分化及鑒定

BMSCs 加入脂肪誘導液誘導2 周后，細胞中有大小不等的脂肪滴出現，細胞逐漸由原來的梭形變為圓形或多角形，經油紅O 染色，蘇木素復染核，鏡下觀察可見脂滴為橙紅色，胞核為藍色，見圖3A。BMSCs 經成骨誘導液誘導2 周后，細胞轉變為多角形細胞，呈多層重疊生長，可觀察到較大的細胞結節，有明顯的鈣沉積，茜素紅S 染色后鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結節，為茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色的復合物，見圖3B。

圖3 大鼠骨髓間質干細胞成脂成骨誘導分化鑒定

3 討論

骨髓間質干細胞是骨髓內除造血干細胞之外的另一類干細胞，是骨髓造血微環境的重要組成部分。BMSCs 在全骨髓中比例很低，只占骨髓有核細胞總數的0.001%～0.01%[9]。目前已經建立了多種體外分離培養BMSCs 的方法，主要有全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法，不同的方法具有不同的優缺點[1，10]。全骨髓貼壁培養法基于BMSCs 的粘附特性，是獲得這種細胞的最簡單方法。本實驗采用的是全骨髓貼壁培養法，用L-DMEM + 10% FBS 作為基本培養基，通過反復、 多次換液去除未貼壁的造血干細胞，獲得貼壁生長的BMSCs，通過傳代進行純化和擴增培養。研究顯示，體外培養的BMSCs，在形態上呈紡錘形成纖維細胞狀，能貼壁生長，呈螺旋狀或漩渦狀[11]。該研究也證實了上述觀察結果。

BMSCs 的多向分化潛能受到多種因素的影響，研究表明，MicroRNA-9-1 可增加BMSCs 向神經細胞的分化比率[12]，熟地含藥血清能夠促進BMSCs 向神經細胞的分化[13]。王貞等[14]研究發現，人血小板裂解液可以促進BMSCs 成骨分化，抑制其成脂分化，朱小虎等[15]證實硝酸甘油也可促進BMSCs 向成骨分化。BMSCs 的疾病治療方面也得到廣泛的研究，并取得較好的實驗結果，BMSCs 經BMP-2 預誘導后移植治療大鼠再灌注后心肌梗死，對心肌梗死再灌注損傷有一定治療作用[16]。BMSCs 聯合腦源性神經營養因子用于大鼠腦出血的實驗研究發現[17]，移植后可促進大鼠腦出血損傷部位結構和功能的修復。

該研究利用骨髓全貼壁培養法成功分離培養了大鼠BMSCs，所得細胞具有間質干細胞的生物學特性，具有多向分化潛能，這將為進一步的實驗研究和應用打下堅實的基礎。

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