光譜法研究羧甲基殼聚糖與牛血清白蛋白的相互作用

葛杏莉，賈　弦，汪　鑫，齊　炎，夏彩芬

(湖北工程學院 化學與材料科學學院，湖北 孝感 432000)

光譜法研究羧甲基殼聚糖與牛血清白蛋白的相互作用

葛杏莉，賈弦，汪鑫，齊炎，夏彩芬*

(湖北工程學院 化學與材料科學學院，湖北 孝感 432000)

摘要:采用熒光光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法和圓二色譜法研究了羧甲基殼聚糖(CMCS)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用過程及機理。研究結果表明，CMCS對BSA的內源熒光有猝滅作用，且為靜態猝滅；紫外光譜分析表明，CMCS與BSA分子發生了相互作用，形成了基態復合物；圓二色譜和紅外光譜分析結果表明，CMCS與BSA中肽鍵發生作用，α-helix結構含量發生改變，使BSA二級結構發生變化；三維熒光的實驗結果表明，當在BSA中加入CMCS后，分子全局的內源熒光強度明顯降低；同步熒光和位點競爭實驗結果表明，CMCS與BSA 的結合位點更接近于色氨酸殘基，結合部位為Site I。

關鍵詞：羧甲基殼聚糖；牛血清白蛋白；熒光光譜法；圓二色譜法；紫外光譜法

中圖分類號：O636.1

文獻標志碼：碼：A

文章編號：號：2095-4824(2015)03-0005-07

收稿日期：2015-03-25

基金項目：湖北工程學院生物質資源轉化利用湖北省協同創新中心項目(XTCX041)

作者簡介：葛杏莉(1962-)，女，湖北通城人，湖北工程學院化學與材料科學學院實驗師。

通訊作者夏彩芬(1979-)，女，湖北武漢人，湖北工程學院化學與材料科學學院講師，博士，本文。

Abstract：The interaction process and mechanism between carboxymethyl chitosan (CMCS) and bovine serum albumin (BSA) are investigated by means of fluorescent spectrometry, ultraviolet spectroscopy, infrared spectroscopy, and circular dichroism (CD). And it is found that the fluorescence quenching of BSA accorded with the CMCS concentration-dependent. And the Stern-Volmer curve of the fluorescence quenching of BSA by CMCS shows that the mechanism is mainly static quenching. The UV indicates that the BSA molecules are combined with the CMCS, forming a complicated ground-state. The analytical results with the CD and infrared spectroscopy indicate that the peptide bonds within the CMCS and the BAS are affected each other and the α-helix content of BSA is changed with CMCS by CD, leading to the changes of secondary structure in the BSA. The experimental result with three-dimension fluorescence shows that the strength of overall intrinsic fluorescence is significantly reduced when the CMCS is added into the BAS. The results with the synchronous fluorescence and the site competition suggest that the binding sites between the CMCS and the BSA are more close to tryptophan residues, where the binding sites are located at Site I.

賈弦(1991-)，女，湖北荊州人，湖北工程學院化學與材料科學學院學生。

羧甲基殼聚糖(CMCS)是殼聚糖的高級衍生物之一。近年來，由于羧甲基殼聚糖在藥物載體體系、組織工程及生物改良支架等方面具有廣泛的應用前景，已成為發展迅速的一種生物醫用材料[1-3]。

CMCS是由殼聚糖衍生而來的一種兩親性醚，與殼聚糖相比，有更好的水溶性、更優異的生物相容性、可控生物降解性、成骨能力及一些其他優秀的物理化學、生物學性能[4-5]。更為獨特的是，CMCS可負載疏水性藥物并顯示出良好的生物活性，這種優良特性使其在生物醫用材料領域有望成為明星材料，它不僅可作為藥物載體，也可制備無紡布、流延膜、涂層紗布、止血海綿、術后防粘連材料等多種醫用敷料。

作為具有重要應用前景的生物醫用材料，CMCS一旦作用于生命體系，必然會與體內生物大分子發生相互作用。盡管目前CMCS用于大分子檢測方面的研究已有相關報道[6-7]，但多是從體系是否符合經典的Stern-Volmer方程線性相關來做出判斷，顯然并不全面系統。血清白蛋白常作為代表性蛋白質用于生物醫用材料領域的研究[8]，它可以與許多外源性物質(如有機小分子、金屬離子等)結合，在生物體內起到存儲與轉運作用[9]，是科學研究中經常使用的藥物靶標蛋白之一[10]。

本文主要利用多種光譜聯合使用的手段研究近似生理條件下CMCS與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，探討CMCS-BSA體系的猝滅作用機理、結合模式、結合部位等內容，并深入考察了CMCS對BSA二級結構的影響以及兩者結合點的部位。

1　材料與方法

表1是試驗所用的主要試劑。

表1　實驗試劑

1.2　主要實驗儀器

表2是試驗中所用的主要儀器。

1.3　實驗方法

1.3.1　熒光光譜法

①熒光變溫實驗：配制4×10-3mol/L的CMCS溶液。以280 nm為激發波長，先測試BSA(1×10-5mol/L)的熒光吸收光譜，再依次加入一定量的CMCS溶液，分別測試293 K、298 K、303 K時各體系的熒光吸收光譜，根據所得數據計算猝滅常數和結合常數。

②位點競爭實驗：采用熒光光譜法，固定BSA的濃度，向BSA-CMCS體系中分別加入一定量的華法林和布洛芬，以280 nm為激發波長，繪制研究體系的熒光光譜，根據所得數據判斷結合位點。

③三維熒光光譜：分別掃描BSA和BSA-CMCS體系的三維熒光光譜，初始激發波長選擇280 nm，在200～400 nm之間記錄發射光譜，選擇間距為10 nm，掃描次數為20次。

④同步熒光試驗：采用熒光光譜法，固定BSA的濃度，逐次加入等量CMCS溶液，分別測試Δλ= 15 nm 和Δλ= 60 nm下的熒光光譜圖。

1.3.2　紫外光譜法

分別測試BSA和BSA-CMCS體系的紫外光譜，其中 BSA-CMCS體系中CMCS濃度為梯度分布。

1.3.3　紅外光譜法

用傅立葉紅外光譜儀分別測試CMCS與CMCS-BSA體系的在室溫下的FTIR圖譜。其中CMCS-BSA體系預先在2～8 ℃下溫浴1 h而得，分別測試各體系的紅外光譜。

1.3.4　圓二色譜法

測定20 ℃下BSA和CMCS-BSA體系的遠紫外圓二色譜，分析CMCS作用前后BSA二級結構變化。

2　分析與討論

2.1　CMCS與BSA相互作用的穩態熒光分析

BSA分子中色氨酸和酪氨酸殘基是其內源熒光的主要來源，當激發光波長為280 nm時，在340 nm附近有很強的熒光峰；而CMCS在340 nm 處沒有熒光特性(圖1中未標出)，表明CMCS不會產生與BSA相互影響的熒光。本實驗中，設定BSA的濃度為1.0×10-5mol/L，隨著體系中CMCS用量的增加，BSA的內源熒光發生顯著的猝滅現象，實驗結果如圖1所示。

圖1　CMCS對BSA熒光光譜的影響(T=298 K)

由圖1結果可知，在BSA中加了CMCS后，BSA的熒光強度顯著降低，表明CMCS對BSA的內源熒光有猝滅作用，且猝滅作用顯示出明顯的CMCS濃度依賴性。

2.2　CMCS與BSA相互作用的猝滅類型

2.2.1　變溫熒光實驗

為研究熒光的猝滅機理，通常將猝滅過程分為動態猝滅和靜態猝滅來討論[11]。整體而言，任何一個猝滅過程均是包含動態和靜態猝滅的混合過程，可用如下方程來描述：

(1)

式中：F代表體系中存在猝滅劑時體系的熒光強度，F0代表不存在猝滅劑時體系的熒光強度：KD與KS分別為動態與靜態的猝滅常數，[Q]是猝滅劑的濃度[12-14]。

若猝滅過程表現為靜態猝滅(動態部分可忽略)，即猝滅劑與熒光物質在基態時生成較穩定的不產生熒光的復合物，從而導致熒光強度降低，則式(1)變為：

(2)

式中：Ksv是靜態猝滅常數。

由公式(1)和(2)可知，在猝滅劑合適的濃度范圍，靜態猝滅過程中F0/F 與濃度[Q]之間應存在線性關系。通常，判斷猝滅方式的本質可通過變溫熒光實驗得出。對于動態猝滅，其猝滅常數會隨著溫度升高而增大，而溫度升高可能導致基態配合物穩定常數(Ksv)下降，從而削弱靜態猝滅的程度。因此，可以通過考察不同溫度下BSA的Ksv變化來區分猝滅類型。為此，實驗中檢測了不同溫度(293K、298K和303K)時，CMCS對BSA的熒光猝滅情況，結果如圖2所示。

圖2　不同溫度時CMCS與BSA相互作用的猝滅常數

根據公式(2)，以(F0-F)/F對[Q]作圖，發現在293 K時，CMCS與BSA的相互作用猝滅常數Ksv= 3.80×103L/mol；在298 K時，Ksv= 3.25×103L/mol；在303 L/mol；在298 K時，Ksv= 3.25×103L/mol；在303 K時，Ksv=2.73×103L/mol。該結果表明，隨著溫度的升高，CMCS與BSA的相互作用猝滅常數Ksv隨著體系溫度的升高呈現規律性的減小，由此推斷CMCS對BSA的猝滅過程符合靜態猝滅特征。

2.2.2　CMCS與BSA相互作用的結合常數

CMCS對BSA的猝滅過程具有靜態猝滅特征，因此其實驗數據可用修正的Stern-Volmer方程處理[15]：

(3)

圖3　CMCS猝滅BSA熒光的關系圖

根據公式(3)， 對1/[Q]作圖，線性擬合后Ka分別為1.84×104mol/L (293 K)、1.90×104mol/L(298 K)、2.09×104mol/L(303 K)，結果如圖3所示。圖3的結果表明，隨著溫度升高，CMCS-BSA體系結合常數呈增大趨勢，這一結果符合CMCS對BSA的靜態猝滅機理。

2.2.3　紫外光譜分析

文獻[15]表明：動態分子只在熒光分子處于激發態時才存在，因而猝滅劑對熒光分子的紫外可見吸收光譜一般不產生影響；而靜態猝滅則涉及基態復合物的生成，該復合物一般會使熒光分子的吸收光譜發生改變[16-17]。據此，本文又設計了CMCS對BSA的紫外吸收光譜的影響，結果如圖4所示。

從圖4的結果可以看出，BSA分子在280 nm處有很強的吸收峰，當把CMCS加入BSA中時，其紫外圖譜在280 nm處的吸收增強，且發生微弱藍移，說明CMCS與BSA分子間發生了作用，形成基態復合物，進一步證明了其猝滅類型為靜態猝滅。

圖4　CMCS對BSA紫外光譜的影響(T=298 K)

綜合以上變溫熒光和紫外光譜的分析結果，可以判定CMCS對BSA的猝滅過程符合靜態猝滅特征。

2.3　CMCS對BSA二級結構的影響

2.3.1　紅外光譜分析

BSA分子中肽鍵(-NHCO-)的特征振動譜帶、主鏈骨架及側鏈的振動譜帶等都能通過紅外光譜進行表征。-NHCO-的結構環境是蛋白質主鏈構象的重要反映，也是其能正常發揮生理功能的重要依據[13]。因此，可以根據-NHCO-的特征振動譜帶來推測BSA的主鏈構象。本實驗中也檢測了CMCS存在時BSA結構的變化，結果如圖5所示。

圖5　CMCS與BSA相互作用的FTIR圖

從圖5的結果可以看出，BSA分子中的肽鍵在1 644.0 cm-1處有很強的吸收，當把CMCS溶液加入到BSA中時，其紅外圖譜在1 647.0 cm-1處的吸收峰變窄，吸收減弱，且發生了藍移，說明CMCS與BSA分子的肽鍵發生了相互作用。波數在1 650～1 658 cm-1處的峰面積代表蛋白質中α-helix的含量[12]，可知在CMCS存在的情況下，BSA中α-螺旋的含量有所減少。

根據以上分析結果，可以推斷CMCS與BSA分子的肽鍵發生了作用，其相互作用過程中使BSA的二級結構發生了變化，即α-helix含量減少。

2.3.2　圓二色譜分析

圓二色譜(CD)在研究蛋白質結構方面具有獨特的優勢，不僅可以在接近生理條件下對蛋白質實行低濃度、無損傷的分析，為蛋白質的構象變化提供相關信息，而且還可以定量推算出其分子中ɑ-helix、β-fold以及無規則卷曲的含量等。因此，該方法在蛋白質立體結構分析中具有廣泛的應用前景，成為解析蛋白質構象變化的有效方法。為了進一步驗證CMCS對BSA構象變化的影響，本實驗中還考察了BSA、CMCS-BSA兩個體系中CD譜的變化，實驗結果如圖6所示。

圖6　CMCS與BSA相互作用的CD譜

從圖6中的結果可知，BSA分子的CD譜是雙負峰形的，分別位于208 nm和222 nm處，隨著CMCS加入到BSA中，BSA分子在208 nm和222 nm這兩處的負峰振幅緩慢降低，表明BSA分子的二級結構發生了改變，ɑ-helix含量出現減少現象，該結果與前述FTIR的分析一致，表明BSA分子的肽鏈結構在CMCS的作用下有所伸展。

2.3.3　CMCS與BSA的同步熒光分析

同步熒光光譜可以反映外源物對蛋白質構象變化的影響。Δλ=60 nm 的同步熒光譜代表著色氨酸殘基的光譜特征，而Δλ=15 nm 的同步熒光譜則顯示出酪氨酸殘基的光譜特征。由于芳香氨基酸殘基的λem與其所存在環境的極性有關聯，因此，蛋白質構象的改變可由λem的變化來進行判斷[15]。

圖7(Δλ = 60 nm)的結果表明，在固定BSA 濃度時，隨著CMCS濃度的逐漸增加，BSA熒光強度逐漸降低，λem也略有藍移，表明色氨酸殘基所處的微環境疏水性緩慢增加，其親水性逐漸降低。圖8(Δλ = 15 nm)顯示，隨著CMCS濃度的增加，BSA熒光強度與穩態熒光結果(見圖1)相比沒有變化。由圖8和圖9結果可知，同步譜中色氨酸殘基熒光強度的降低程度比酪氨酸殘基的更加明顯。因此，可以推測CMCS與BSA的結合位點更趨近于色氨酸殘基。

圖7　Δλ=60 nm時CMCS-BSA體系的同步熒光光譜

圖8　Δλ=15 nm時CMCS-BSA體系的同步熒光光譜

2.4　CMCS作用于BSA體系的三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅能夠直觀地體現蛋白質分子在不同條件下的構象(微環境)變化，而且可以全面顯示出待測物的熒光信息，據此可以得到更加科學可靠的蛋白質特征構象變化信息。

BSA的三維熒光圖譜如圖9(a)所示。可以看出，當在BSA中加入CMCS后，其強度則明顯降低，這是由于與BSA發生靜態猝滅導致體系的熒光強度全面下降的結果。上述結果表明在BSA中加入CMCS后，分子全局的內源熒光強度明顯降低。

圖9　CMCS作用于BSA體系的三維熒光光譜

2.5　CMCS與BSA結合部位的確定

為明確CMCS與BSA相互作用的結合位點，本實驗設計并檢測了位點標記物布洛芬(ibuprofen)和華法林(warfarin)對CMCS-BSA體系的影響。

從X-射線結晶學研究結果得知，標記物華法林(warfarin)的結合位點位于亞結構域IIA(site I)，而布洛芬(buprofen)的結合位點位于亞結構域IIIA(site II)處[18-19]。本實驗通過檢測標記物存在時CMCS與BSA作用體系的熒光強度的變化，從而確定CMCS的結合位點。

由圖10可知，向BSA溶液中加入布洛芬后熒光強度有所下降，依次向BSA與布洛芬體系混合液中逐漸滴加CMCS，體系的熒光強度有規律地下降，此時熒光譜與不存在布洛芬時大致相同。相比而言，華法林的存在對CMCS-BSA體系的熒光強度的影響較為明顯(見圖11)。當加入過量的華法林后BSA溶液的熒光強度顯著下降，向混合液中連續滴加CMCS，熒光強度緩慢降低，其熒光強度遠小于不存在華法林時的熒光強度。上述現象表明，華法林對CMCS-BSA體系的熒光強度的影響較大，而布洛芬對其幾乎沒有影響。由此可以推斷，華法林與CMCS競爭同一個位點，CMCS在BSA上的主要結合位置為Site I。

圖10　布洛芬對CMCS-BSA體系的影響

圖11　華法林對CMCS-BSA體系的影響

3　結論

本文采用熒光光譜法、紫外光譜法、圓二色譜法和紅外光譜法系統考察了CMCS與BSA的相互作用方式及機理。研究結果表明，CMCS可使BSA的內源熒光發生猝滅，且猝滅作用表現出對CMCS濃度的依賴性，猝滅過程符合靜態猝滅機理。進一步研究還發現，BSA經CMCS作用后，其二級結構發生變化，α-helix的含量有所減少，同步熒光光譜和位點競爭的實驗證實了CMCS與BSA的結合位點更接近于色氨酸殘基，具體結合位置為BSA的亞結構域IIA (Site I)處。

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Study on Interaction of Carboxymethyl Chitosan and Bovine Serum Albumin by Spectrometry

Ge Xingli, Jia Xian，Wang Xin，Qi Yan，Xia Caifen*

(SchoolofChemistryandMaterialsScience，HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Key Words：carboxymethyl chitosan; bovin serum albumin; fluorescent spectrometry; circular dichroism; ultraviolet spectrometry

(責任編輯：張凱兵)