人類免疫缺陷病毒耐藥檢測研究進展

邱宇鶴　何淑云　王錦

[摘要] 艾滋病抗病毒治療對于病毒抑制和患者生存意義重大，但病毒耐藥問題的出現已成為治療的嚴重威脅，不僅會導致個體治療的失敗，也會引發耐藥毒株的傳播風險，因此開展耐藥檢測工作十分必要。本文對耐藥檢測的意義、方法和應用研究最新進展加以綜述，從臨床和公共衛生的角度為進一步加強耐藥檢測工作，更有效的降低耐藥的發生、傳播和流行提供參考依據。

[關鍵詞] 艾滋病；人類免疫缺陷病毒；耐藥檢測

[中圖分類號] R512.91 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）19-30-04

[Abstract] Antiviral therapy of acquired immunodeficiency syndrome （AIDs） is of great importance for virus inhibition and the survival of patients， but drug resistance of virus has been recognized as a serious threat to treatment， leading to failure of individual treatment and spreading risk of the drug resistant strains. Thus， drug resistance detection is very necessary. This paper generalizes the latest progress of significance， methods and applicative research of drug resistance to provide clinical and public health references for the further improvement of drug resistance detection and further reduction of occurrence， spreading and prevalence of drug resistance.

[Key words] Acquired immunodeficiency syndrome； Human immunodeficiency virus； Drug resistance detection

近年來艾滋病抗病毒治療工作呈現全球性的迅速發展，接受有效的抗病毒治療對于抑制病毒復制，降低發病率和死亡率，提高生命質量具有重要意義。但目前人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）耐藥已成為抗病毒治療的重要問題，不僅會影響個體自身治療，并且會引起耐藥毒株傳播流行的社會風險。面對HIV耐藥現狀，開展耐藥檢測不僅能夠指導評估、選擇和優化調整臨床治療方案，還能夠為分析耐藥毒株的流行狀況、有效制定公共衛生防治策略提供科學依據。

1 HIV耐藥現狀

用于艾滋病治療的抗病毒藥物現已發展至6大類[1]，而治療方案也發展為不同分子靶點的多種藥物聯合作用，但是耐藥的出現嚴重影響治療效果，并且隨著抗病毒治療的推廣普及，HIV耐藥在全球已呈廣泛流行趨勢。Pham等[2]在2014年的一項系統性研究中指出，2009～2013年中/低收入國家高危人群的耐藥率較2004 ～ 2008年升高了近一倍，形勢非常嚴峻。更值得重視的是，耐藥的發生不止針對一線藥物，隨著新的抗病毒藥物及治療方案的應用，新的耐藥突變也在不斷出現，當前HIV耐藥已經成為導致抗病毒治療失敗的主要因素[3]。

HIV耐藥是指HIV在通常能夠抑制其復制的藥物存在情況下復制的能力[4]，病毒逆轉錄酶缺乏校正功能，復制過程中存在高頻錯誤傾向（約3×10-5 突變/堿基/復制周期）[5]，而病毒高速復制的特點加速了感染進程中病毒突變的積累，在機體自身免疫和抗病毒藥物的選擇壓力下篩選出耐藥優勢株。如果患者服藥依從性低引起血藥濃度波動，會增加發生耐藥的危險，對云南德宏州艾滋病患者接受抗病毒治療后耐藥突變情況的研究發現[6]，在353例成功進行耐藥相關基因位點突變檢測的患者中，有198例（56.1%）發現耐藥基因突變。HIV耐藥不但會影響患者自身治療效果，更會引起耐藥毒株流行的公共衛生問題。如楊洪等[7]報道2011年我國涼山州未治療人群原發耐藥率為5.43%（7/129），達到中度流行狀態。因此有效開展HIV耐藥檢測對于指導個體治療和防控HIV耐藥傳播都具有十分重要的意義。

2 HIV耐藥檢測方法

2.1 表型耐藥檢測

表型耐藥檢測原理是通過檢測在體外不同濃度抗病毒藥物存在情況下HIV病毒的復制能力，評價病毒對藥物的敏感性，結果以所檢毒株的50%抑制濃度（50% Inhibitory Concentration，IC50）與作為對照的野生毒株的 IC50的倍數改變來表示[8]，適用于復雜多位點的耐藥性突變檢測，可以用于評估新的抗病毒藥物。

作為傳統檢測方法，外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培養法通過p24抗原定量來計算待測毒株的IC50，實驗條件要求嚴格，對于技術和費用的需求標準較高，同時在培養過程中存在誘導出耐藥優勢株的風險，應用具有局限性。除PMBC外，還有一些細胞系可作為指示細胞，比如穩定表達CD4、CXCR4和CCR5受體的TZM-b1，并且TZM-b1細胞也可以被假病毒所感染[9]。以重組技術為基礎的假病毒表型耐藥檢測是將擴增的HIV特定區域基因插入載體，用構建的重組病毒進行檢測。目前商品化的檢測試劑盒主要有：AntivirogramlTM、PhenoSense GTTM和PhenoscriptTM。假病毒表型耐藥檢測具有較高的安全性，過程相對較為快捷，能夠檢測病毒載量較低的樣本。徐萌等[10]通過構建40株包含患者基因片段的假病毒對6組不同單藥和多藥進行表型耐藥檢測，成功定量評估了樣本的耐藥水平，而楊婧等[11]對比研究了5種藥物的真病毒和假病毒表型耐藥檢測情況，數據表明兩種方法一致性較高，僅有對于齊多夫定的一個檢測結果存在耐藥程度的不同，其結果為假病毒表型耐藥檢測推廣應用的適宜性提供了更多的支持。endprint

2.2 基因型耐藥檢測

基因型耐藥檢測基于分子生物學方法，擴增基因組中耐藥相關的特定區域目的基因片段并進行序列測定，利用數據庫進行結果解釋，操作簡單，所用時間短。標準的基因型耐藥檢測的對象主要是蛋白酶和逆轉錄酶區域，隨著更多不同靶向藥物如整合酶抑制劑、CCR5拮抗劑等的應用，檢測范圍也在不斷拓展[12]。Kagan等[13]在CCR5/CCR2雙重拮抗劑的臨床Ⅱ期試驗中比較了基因型和表型耐藥檢測，發現二者具有較高的一致性，而基因型耐藥檢測在檢測周期和成本上具備優勢。

常用的HIV耐藥基因型檢測商品化試劑盒有TRUGENETM和ViroSeqTM，具備對應的耐藥數據庫，檢測成本昂貴。實驗室自建的In-house方法一般用巢式PCR方法進行擴增，結果分析常用斯坦福大學耐藥數據庫（Stanford HIVdb），在常規化推廣中表現出更好的性價比[14]。李晶等[15]對In-house方法和TRUGENETM、ViroSeqTM兩種商品化試劑盒的檢測結果比較研究發現，三種方法的一致率達到99.42%（2933/2950）。病毒載量達到1000拷貝/毫升被認為是推薦進行耐藥檢測的閾值，但對低水平病毒血癥的患者開展耐藥檢測正在逐漸引起更多的重視。Gonzalez-Serna等[16]的研究顯示，采用實驗室自建方法，病毒載量在50 ～ 249 拷貝/毫升之間的樣本成功率為74%，大于250 拷貝/毫升的成功率可以達到90%。

目前用于基因型耐藥檢測的樣本主要為抗凝全血或血漿，但對于樣本的保存運輸條件要求較高。以濾紙作為載體的干血斑（Dried blood spots，DBS）樣本具備易采集處理、危險性低、便于儲存運輸、費用低廉的優勢，適合在資源環境條件有限的地區推廣應用[17]。馬鵬飛等[18]研究發現，應用實驗室自建方法，36份樣本中DBS的耐藥檢測結果有31份與血漿相比完全一致（86%）。但濾紙載體樣本也存在樣本量小、對于低病毒載量的患者檢測不準確等問題，WHO HIV耐藥實驗室策略[19]中指出，干血漿斑（dried plasma spot，DPS）和干血清斑（dried serum spot，DSS）樣本不適合于耐藥監測調查。

2.3 虛擬表型耐藥檢測

作為新型耐藥檢測方法的虛擬表型耐藥檢測在2001年由Graham等報道[20]，其原理是通過將基因型檢測結果的序列信息提交基因型-表型匹配的大容量數據庫，通過數據比對鑒別出與患者所帶毒株相似的基因型， 評估其對應的表型信息的平均IC50 ，以分析所測毒株的可能表型。Jiamsakul等[21]研究顯示，基于Stanford HIVdb的基因型和基于vircoTYPETM的虛擬表型耐藥檢測結果具有高度一致性。前文的Gonzalez-Serna等[16]也使用了虛擬表型方法進行重復分析，獲得了非常相似的結果。虛擬表型耐藥檢測本質上是對基因型耐藥檢測結果的二次分析，是建立在實驗室的具體檢測結果上的一種間接性預測，與表型耐藥檢測相比檢測成本低，顯著節約工作時間，已經在美國、歐洲等推薦使用[22]，比如McFaul等[23]用虛擬表型方法有效評價了2011 ～ 2013年在倫敦未治療HIV感染人群中的的耐藥流行情況。

3 HIV耐藥檢測的應用

HIV耐藥檢測對于個體抗病毒治療和公共衛生層面的艾滋病防控工作意義重大。在臨床工作中，耐藥檢測能夠指導臨床醫生對于患者進行科學管理，優化治療方案，提高抗病毒治療質量。相對應的是在治療藥物的選擇上，具備高耐藥屏障的藥物如整合酶抑制劑度魯特韋與其他藥物的聯合使用也更加受到關注[24]。我國艾滋病診療指南[25]推薦在抗病毒治療病毒載量下降不理想或抗病毒治療失敗需要改變治療方案時，和條件允許時在抗病毒治療前，進行HIV基因型耐藥檢測。美國成人及青少年艾滋病抗病毒治療指南[1]建議對于已知或可能存在復雜耐藥突變位點，特別是蛋白酶抑制劑耐藥的情況下，聯合使用表型和基因型耐藥檢測。Luz等[26]在巴西的研究指出，在抗病毒治療開始前的基因型耐藥檢測能夠延長預期壽命和節約成本，獲得更高的健康收益。

在公共衛生領域，開展耐藥檢測有助于研究人員掌握HIV耐藥毒株的流行狀況、傳播趨勢和變化規律，科學有效的評估和應對HIV耐藥風險。我國自2005年開始對HIV耐藥檢測方法進行室間平行比對，至2009年已有19個省23家省市級實驗室參加，累計提交的95份結果顯示97.7%總序列陽性率，78.9%耐藥位點判讀完全一致率，76.8%序列編輯分析一致率，檢測能力和質量總體不斷提高[27]。考慮到直接來源于臨床樣本的考核品在安全性和穩定性等方面要求嚴格，羅慧景等[28]提出將包含耐藥目的基因的重組質粒作為基因型能力驗證考核品，能夠達到反復凍融5次以上而保持穩定性。HIV耐藥檢測是耐藥監測工作的重要內容，在確保耐藥檢測質量，提升檢測技術的基礎上，將HIV耐藥檢測與流行病學調查相結合，有效分析耐藥相關影響因素，可以為完善HIV耐藥的預防和控制策略提供參考，如肖占沛等[29]對江蘇省艾滋病患者耐藥及影響因素的調查研究結果顯示，不穩定的居住狀況和低收入水平可能作為服藥依從性的相關因素影響耐藥，提示需要對于此類型重點人群給予更多的關注和干預。因此，做好HIV耐藥檢測工作，能夠為降低HIV耐藥的發生、傳播和流行，加強艾滋病防治工作提供科學指導和支持。

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（收稿日期：2015-07-21）endprint