電針對缺血缺氧性腦損傷大鼠p—AKT表達的影響

曹娜　徐濤

[摘要] 目的 探討電針治療對大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護作用。 方法 新生7日齡SD大鼠90只隨機分為假手術組、模型組、電針組（假手術組僅分離雙側頸總動脈），每組再分為3d、7d、21d三個亞組，結扎雙側頸總動脈建造缺血缺氧性腦病模型。HE染色和透射電鏡觀察腦組織病理和超微結構，酶聯免疫吸附試驗測定血清中p-AKT蛋白的變化。 結果 病理顯示，模型組神經元損傷較重，且隨著時間的延長，損傷加重。電針組神經元損傷明顯減輕，21d亞組接近于假手術組。電針組血清中p-AKT蛋白水平均有不同程度增加，明顯高于同時間點模型組（P<0.05）。 結論 電針可促進缺血缺氧性腦損傷后神經元修復，其作用機制可能與p-AKT表達增加有關。

[關鍵詞] 電針；缺氧缺血性腦病；p-AKT；大鼠

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）19-47-04

[Abstract] Objective To explore the neuroprotective effect of electric acupuncture on hypoxic-ischemic brain damage in rats. Methods Total of 90 cases of new-bore aged 7d SD rats were randomly divided into sham-operated group without ligating bilateral common carotid artery， model group and electric acupuncture group which subdivided into three groups of 3d， 7d and 21d. The rats were established hypoxic-ischemic encephalopatly （HIE） models by occluding bilaterally the common carotid arteries. The pathology and ultrastructure of neuron were observed by HE staining and electric microscopy， and the serum level of p-AKT were detected by enzyme-linked immunoabsorbance assay. Results The HE staining shown that the neurons were more damaged along the time longed， while in the electric acupuncture group the neurons were less damaged and similar to the sham-operated group in 21d group. The serum level of p-AKT increased in any extent and significant higher than that in model group at the same time （P<0.05）. Conclusion It is suggested that electric acupuncture could promote the neuronal repair after hypoxic-ischemic brain damage， which might be related to the more expression of p-AKT.

[Key words] Electric acupuncture； Hypoxic-ischemic encephalopatly； p-AKT； Rats

新生兒圍產期窒息導致的缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒期的常見疾病，是導致兒童智能落后和腦性癱瘓、癲癇等神經系統傷殘的主要原因之一。缺血缺氧性腦病后神經細胞壞死及凋亡而導致神經元大量缺失是其導致神經功能缺損的病理基礎[1]。缺氧缺血腦損傷后PI3K-AKT信號通路中的p-AKT蛋白表達增加，并參與HIBD中的病理損傷過程，它通過影響下游多種效應分子的活化狀態，在細胞內發揮著抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用，同時具有減少氧自由基的生成、抑制炎癥反應等作用。研究表明，PI3K-AKT通路的過度激活可導致腫瘤的出現[2]，但p-Akt蛋白的增加對缺血缺氧性腦病有保護作用。既往研究[3-4]發現，缺血可誘導p-AKT蛋白表達，隨著再灌注時間的延長其表達會下降。針刺治療對缺血缺氧性腦損傷具有獨特療效，但具體機制尚不清楚。本實驗通過建立新生大鼠缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopatly，HIE）模型，觀察針刺百會、大椎、曲池、涌泉四穴對神經細胞及p-AKT表達的影響，進一步探討針刺對缺血缺氧性腦損傷的療效及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

SPF級7日齡SD大鼠90只，雌雄不限，體重14～18g，由青島市藥物檢測中心提供，合格證號：scxk魯20140003。室溫20～25℃，母鼠喂養。按區組隨機法分為兩組假手術組24只及HIE模型組66只。HIE模型組造模期間死亡18只。將最終造模成功的48只大鼠隨機分為兩組：模型組、針刺組。每組24只，于術后3d、7d、21d進行取腦檢測各項指標，每個時間段8只。

1.2 模型建立

大鼠經乙醚吸入麻醉。采用Rice方法并加以改進[5]，結扎雙側頸總動脈，縫合切口。除假手術組，模型組和電針組大鼠置于透明密閉容器中以0.5L/min的速度通入低氧混合氣體（濃度為8%氧氣和92%氮氣），建立缺氧缺血性腦損傷模型。缺氧1.5h后將大鼠放回鼠籠，術后2h仍未蘇醒或死亡的動物剔除。endprint

1.3 電針干預方法

（1）假手術組：僅分離雙側頸總動脈不作任何處理；（2）模型組：分離雙側頸總動脈并結扎，縫合切口，不另作任何治療；（3）電針組：缺血缺氧后第2天起，用0.5寸毫針，直刺大椎5mm；沿皮斜刺百會5mm、直刺曲池10mm、速刺涌泉微出血即可。百會、曲池與電針治療儀進行連接，以穴位周圍皮膚微顫即適，非對稱雙向連續脈沖波、5～10Hz、3～5V，每日1次，每次10min。以上穴位定位參照大鼠常用的針灸穴位[6-7]。

1.4 觀察指標

1.4.1 病理切片 每亞組隨機選取4只動物，應用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛溶液200mL，完整取腦，切取視交叉后腦組織（5mm）置4%多聚甲醛溶液后固定2h，蒸餾水浸泡4h。常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續切片，厚5μm，貼片，4℃保存。石蠟切片常規脫蠟水化，蘇木精-伊紅染色，光鏡下神經細胞核呈藍色，細胞質呈不同程度的紅色。在400倍顯微鏡（德國，Leica DMI4000B）下，每張切片隨機觀察皮質區4個不重疊的視野計數細胞，取其均值。以變性細胞指數（denatured cell index，DCI=變性細胞數/細胞總數）表示損傷程度。

1.4.2 電鏡觀察 各組幼鼠于缺血缺氧后3d、7d、21d腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，心臟快速灌流生理鹽水50mL，斷頭取腦。在鼠腦前囟前后做冠狀切開，將腦皮質區組織切成1mm厚度置于2.5%戊二醛中固定24h，1%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，環氧丙烷置換，環氧樹脂Epon812包埋，超薄切片50nm，醋酸鈾+硝酸鉛雙染色，透射電鏡觀察神經元的超微結構。

1.4.3 酶聯免疫吸附試驗 各組剩余4只幼鼠于缺血缺氧后3d、7d、21d腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，心尖部取血，在室溫下，血液自然凝固，以3000轉/min離心15min，取上清。p-Akt Elisa試劑盒（Lot. #： SO30708D）由Biosource International，Inc. USA提供，操作步驟嚴格按照說明書進行。在全自動酶標儀450nm處讀板，以OD值和蛋白濃度為橫、縱坐標繪制標準曲線，得出p-AKT的原始數據，根據待測蛋白的濃度和稀釋比例，即可計算出單位濃度總蛋白內p-AKT的含量（unit/mg）。

1.5 統計學處理

實驗結果采用SPSS17.0 統計軟件分析。計量資料以（）表示，多組比較經方差齊性檢驗后，采用析因分析，組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

假手術組神經細胞結構正常，排列整齊緊密， 胞漿呈淡紅色，胞核呈藍色，核仁清晰，各時間點DCI水平較低無明顯差異（P>0.05）。模型組3d，細胞質染色不規則，細胞間隙擴大，神經細胞胞質濃縮、深染，DCI=0.60±0.03，較假手術組明顯升高（t=14.46， P<0.05）；7d神經元壞死明顯，排列紊亂，著色較深，常有核膜破裂，細胞結構消失，可見大量細胞核固縮深染、裂解；21d可見大量神經細胞丟失，遺留大量空泡，DCI=0.78±0.05，為各組最高。電針組3d，神經細胞損傷狀況同模型組，未見明顯變化，DCI=0.54±0.06，較同時間點模型組略低（t=1.69， P>0.05）；7d可見部分神經細胞固縮、深染，但壞死程度及DCI=0.42±0.04較同時間模型組（DCI=0.71±0.05）明顯減輕（t=8.83， P<0.05）； 21d神經細胞腫脹變輕，排列有序，DCI=0.35±0.05，壞死細胞明顯減少。見圖1，表1～2。

2.2 神經元超微結構

假手術組神經細胞排列整齊緊密，高倍鏡下細胞膜完整、細胞核大而圓。模型組術后1d電鏡下大鼠神經元胞膜尚完整，核仁稍增大，常染色質分布不均，線粒體輕度腫脹；3d鏡界模糊，有神經細胞壞死征象，表現神經細胞消失，染色質聚集，雙層核膜模糊不清，21d神經元損傷進一步加重，細胞質溶解，有空泡形成。電針組1d電鏡下神經細胞的改變與模型組相比未見明顯差異；3d電鏡下，神經元胞體水腫減輕，細胞核核膜、核仁逐漸清晰，細胞質空白減少，針刺后21d大鼠神經元與假手術組差別不明顯，胞膜尚完整，核質稍疏松，常染色質尚均勻，偶見腫脹的線粒體及擴張的粗面內質網。見圖2。

2.3 ELISA

ELISA檢測顯示，假手術組大鼠p-Akt水平較低，各時間點間無明顯差異（P>0.05）。模型組p-Akt表達升高，明顯高于同時間點假手術組水平（P<0.05），但隨著時間的延長，p-Akt表達逐漸下降。電針組p-Akt水平較高，且隨著治療時間的延長，p-Akt表達逐漸升高，3d時于模型組無明顯差異（t=0.94，P>0.05），7d和21d時明顯高于模型組（t=9.43，16.02，P<0.05）。見表3～4。

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病是指各種圍生兒期窒息引起的部分或完全缺氧， 腦血流減少或暫停而導致胎兒或新生兒腦損傷，HIE是新生兒神經發育異常和死亡的主要原因之一，可導致各種病發癥，如癲癇、腦癱、智力下降等，重度HIE預后不良率仍高達20.8%[8]，HIBD已經成為全球范圍內一個影響孩子們生活質量的重要因素[9-10]。缺氧缺血性腦損傷的發病機制為二次損傷學說及細胞壞死，目前尚無有效的治療方法。許多研究表明有效針刺治療可抑制神經元凋亡，并促進各種內源性神經營養因子分泌，但電針抑制神經元凋亡的機制尚不明確，本文通過建立HIE大鼠模型，通過針刺百會、大椎、曲池、涌泉四穴，檢測p-Akt通道蛋白濃度變化，了解針刺治療缺血缺氧腦病的機制。

PI3K/Akt 信號通路是與細胞凋亡有關的主要信號轉導通路，是重要的細胞存活信號通路之一[11]。許多研究表明[12-14]，通過激活PI3K/Akt 信號通路可導致腫瘤的產生，抑制PI3K/Akt 信號通路激活可達到治療腫瘤的目的，缺血缺氧性腦病早期便可導致神經細胞的過度壞死及凋亡[15-16]。研究認為，激活PI3K/AKT信號通路是電針對腦細胞的神經保護機制之一[9，17]，可在不同時間點不同程度的降低凋亡細胞百分率，通過本實驗通過病理及電鏡觀察到針刺7d、21d神經元細胞損傷明顯減輕，Elisa檢測發現，電針組細胞中p-Akt蛋白濃度較模型組明顯升高（P<0.05），可見針刺對缺血缺氧性腦病有治療作用。且有研究顯示電針百會、 大椎及涌泉等穴可提高線粒體 Na+- K+- ATP 等酶的活性， 進而提高線粒體的能量代謝能力， 從而減輕腦缺血再灌注損傷[18-20]。由此提示，電針治療缺血缺氧性腦病是通過多途徑、作用于多環節或多靶點來實現的。目前針灸對缺血性腦損傷的諸多保護機制還尚未完全明了，需要應用生物化學、生理學等新知識及新技術進行進一步研究，電針對于p-Akt蛋白表達增加只是治療HIE的很小的一部分，還需要進一步研究發現。endprint

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（收稿日期：2015-06-16）endprint