聚乙烯醇-海藻酸鈉共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶

王衛軍，李世文，朱必玉，魏勝華，陶玉貴，朱龍寶

（安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000）

葡糖糖氧化酶（GOD，EC：1.1.3.4）能夠專一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2，主要應用于食品、醫藥及化工等領域[1].然而由于游離葡萄糖氧化酶穩定性差、使用成本高，限制了其廣泛應用.固定化酶具有與游離酶同樣的催化特性，且易于分離回收利用，能夠連續操作和有效改善酶的穩定性，近年來受到廣泛關注[2].

目前，研究固定化葡萄糖氧化酶的研究比較多[3-4]，而同時固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的研究相對較少.過氧化氫酶的加入，不僅能夠減輕葡萄糖氧化分解過程中產生的H2O2對酶的損傷，而且可以改變酶氧化的微環境[5]，提高葡萄糖氧化酶酶活力.固定化雙酶的載體大多是多糖[6]、無機材料[7]和有機聚合物[8]，其中，聚乙烯醇與海藻酸鈉復合載體以其良好的生物相容性、安全無毒、操作簡單、成本低廉等優點，常作為固定化酶和細胞的載體[9-10].

實驗通過制備聚乙烯醇和海藻酸鈉復合載體，應用包埋法共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，主要對制備條件進行了優化，并研究了固定化酶的性質.

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

葡萄糖氧化酶（江蘇瑞陽生物科技有限公司）；過氧化氫酶（山東棗莊杰諾生物科技有限公司）；聚乙烯醇，海藻酸鈉，硼酸，氯化鈣，葡萄糖，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，磷酸，氫氧化鈉均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）.

1.2 儀器與設備

H H-6恒溫水浴鍋，HYG-3恒溫搖床（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；TD5Z臺式低速離心機（昆明諾金科技有限公司）；AS1201高效液相色譜（大連依利特分析儀器有限公司）.

2 實驗方法

2.1 固定化酶酶活力測定

取1.0 g固定化酶置于50 m L三角瓶中，加入10 m L 含2%的葡萄糖磷酸（p H 6.0，0.2 mol／L）緩沖液，搖瓶在40℃、180 r／min的搖床中反應1 h，取出1 m L反應液100℃滅酶10 min，用高效液相色譜法測定生成的葡萄酸的量[11].

測定條件：甲醇∶水＝5∶95，Na H2PO43.2×10-3m M／L，磷酸調節p H值至2.7，流速1 m L／min，柱溫30℃.

游離酶酶活力測定：取1 g固體酶，加入20 m L磷酸緩沖液，離心取上清液1 m L測定酶活力，操作同固定化酶活測定方法.反應結束后，再加入50μL過氧化氫酶，消除H2O2對于葡萄糖酸測定的影響.

葡萄糖氧化酶的酶活定義為：在40℃每分鐘氧化生成1μmol葡糖糖酸為1個酶活力單位（IU）.

固定化酶與游離酶的相對酶活：在同組實驗中，以酶活最高的作為100%，與其余的固定化酶和游離酶活力之比用百分數表示.

2.2 固定化酶的制備

在燒杯中加入50 m L蒸餾水及一定質量與比例的PVA和SA，水浴加熱至100℃使之完全溶解，冷卻至室溫加入溶解的酶液5 m L，用玻璃棒攪拌均勻，靜置30 min，用注射器滴入含1.5%的CaCl2飽和硼酸溶液中，4℃環境下交聯4 h，球徑保持在3～5 mm，交聯后用蒸餾水清洗3次，置于4℃冰箱保存備用.

2.3 固定化酶酶學性質研究

酶固定化后，由于載體的作用，其與底物的結合能力、最適反應溫度和p H等都有可能發生變化.

（1）最適反應溫度及熱穩定性.將固定化酶和游離酶置于30～60℃環境中測定酶活力，以考察其最適反應溫度的變化.將固定化酶和游離酶置于30～80℃的水浴環境中，靜置1 h，取出測定各組酶活力，考察其熱穩定情況.

（2）最適反應p H及其p H穩定性.將固定化酶和游離酶置于p H值4.0～9.0的底物緩沖液中測定酶活力，以考察其最適反應p H的變化.由于葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，反應體系的p H是不斷下降的過程，所以p H值主要酸性條件下.將固定化酶和游離酶置于p H值2.0～7.0的磷酸鹽緩沖液中，保持6 h，測定各自的酶活力，考察其p H穩定情況.

（3）反應動力學參數.根據Michaelis-Menten米氏方程底物濃度與反應速率的關系，配制不同底物濃度測定其反應速率，每隔5 min取樣測定底物濃度的變化，然后運用Linewaver-Burk雙倒數作圖法，即可求出米氏常數Km和最大反應速率Vmax.

（4）操作穩定性.取1 g固定化酶顆粒置于10 m L 2%的葡萄糖溶液中，搖瓶反應1 h后，過濾得到固定化酶顆粒，重復以上操作6次，測定每次溶液中的葡萄糖酸的含量.

3 結果與分析

3.1 固定化酶制備條件的確定

固定化初始條件為：PVA 8.0%，SA 1.0%，酶活力之比為CAT∶GOD＝5∶1，加酶量為8 mg／m L，以酶活保留為優化指標，對固定化酶的制備條件進行逐步優化.

（1）CAT與GOD酶活力之比的確定.GOD加入量固定，CAT酶活力增加，CAT／GOD的酶活力之比取0∶1、1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1和100∶1，考察最佳的酶活添加比例.酶活力之比對固定化酶的影響如圖1所示.從圖1可以看出，隨著CAT酶活力的增加，GOD酶活力也隨之升高，在CAT／GOD酶活力之比為10∶1時，GOD酶活力達到最高的80%，當酶活力之比大于10∶1時，對于提高GOD酶活力沒有影響.原因是初始CAT酶活力增加，能夠及時分解固定化酶顆粒內部和外部的H2O2，減少了H2O2對于GOD的損傷，而且分解H2O2產生的O2又能促進氧化反應，所以酶活力升高；但是當CAT酶活力再增加，GOD酶活力沒有再升高，原因是GOD的加入量是一定的，過量加入CAT掩蓋了GOD的活性中心，阻礙了與底物的結合，即出現了酶活力下降的趨勢.因此，制備固定化酶顆粒時，GOD／CAT酶活力之比確定為10∶1.

（2）PVA質量濃度的確定.在酶活力之比10∶1條件下，選擇PVA的質量濃度為6.0%～11.0%制備固定化酶顆粒，確定最佳PVA質量濃度.PVA含量對固定化酶的影響如圖2所示.從圖2可以看出，隨著PVA質量濃度的不斷升高，GOD酶活力隨之提高，在PVA含量為9.0%時，酶活達到最高的84%，此時固定化酶成型較好，富有彈力；隨后PVA含量再增加，酶活力出現下降，主要原因是PVA質量濃度過高，制備的固定化酶顆粒粘度高，出現條狀，使固定化酶的比表面積減少，與底物接觸位點減少，導致酶活力下降.故制備固定化酶PVA質量濃度定為9.0%.

（3）SA 含量的確定.選取SA 的質量濃度為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%進行固定化酶的制備，確定SA添加量.SA含量對固定化酶的影響如圖3所示.從圖3可以看出，隨著SA質量濃度的增加，固定化酶的酶活力也隨之升高，在SA含量達到1.5%時，酶活保留率為87%，固定化酶顆粒均勻，表面光滑.其后，SA質量濃度再增加酶活力反而降低.原因是SA質量濃度增大，包埋的酶量也升高；但SA質量濃度過大時，固定化酶顆粒孔變得致密，孔徑變小，底物很難進入顆粒內部，傳質效果差，從而酶活力降低.所以，制備固定化酶的SA質量濃度為1.5%.

（4）加酶量的確定.在 PVA 含量9.0%，SA 含量1.5%條件下，加酶量選取4 mg／m L、6 mg／m L、8 mg／m L、10 mg／m L、15 mg／m L和20 mg／m L 6個質量濃度，確定最佳加酶量.加酶量對固定化酶的影響如圖4所示.從圖4可以看出，加酶量為10 mg／m L時，酶活力最高為90%.隨著加酶量的升高，固定化酶酶活力隨之增加；當加酶量大于10 mg／m L時，酶活保留率出現下降.原因是載體對酶分子包埋量是一定的，加酶量過大，酶分子活性部位被掩蓋，酶活力下降，而且加酶量過大也會出現包埋不穩定，酶容易泄露，導致酶活力下降.即最佳加酶量為10 mg／m L.

3.2 固定化酶酶學性質研究

（1）固定化酶最適反應溫度及其穩定性.溫度對葡萄糖氧化酶催化活力的影響如圖5所示.從圖5可以看出，GOD固定化后最適反應溫度由40℃變為45℃，原因是PVA與SA載體對酶分子提供了保護環境.葡萄糖氧化酶在不同溫度下催化活力的穩定性如圖6所示.從圖6可以看出，不同溫度水浴靜置1 h后，游離酶的失活速率明顯高于固定化酶，固定化酶在80℃環境下剩余酶活近30%，而游離酶近乎失活，熱穩定優于游離酶.

（2）固定化酶最適反應p H及其穩定性.p H對固定化酶催化活力的影響如圖7所示.從圖7可以看出，酶固定化后最適反應p H沒有變化.主要是因為CAT的最適反應p H在6.0左右，而GOD在p H 6.0環境中能保持較高的活力，PVA和SA均屬中性有機聚合物，對于酶分子結構沒有影響.葡萄糖氧化酶在不同p H下催化活力的穩定性如圖8所示.從圖8可以看出，在p H 5.0～7.0緩沖液中放置6 h后，兩者酶活力都能保持90%左右，固定化酶在p H 2.0～4.0的環境中穩定性優于游離酶，具有更好的耐酸性.

（3）酶催化動力學參數的變化.固定化酶和游離酶Linewaver-Burk雙倒數曲線如圖9所示.從圖9可以看出，固定化酶的Vmax為71.3μmol／L，比游離酶的57.5μmol／L升高了24%，固定化酶的Km為10.96，比游離酶的6.81要大，對于底物的結合能力減弱.原因是底物進入固定化酶顆粒內部受到傳質阻力的影響，CAT對G OD的活性中心也起到空間阻礙的作用，此外顆粒內部葡萄糖酸不能及時擴散，也會產生一定的底物抑制作用，致使酶固定化后Km值升高.

（4）操作穩定性.以第一次測得的葡萄糖氧化酶的酶活為100%，連續測定6次固定化酶氧化葡萄糖實驗，以檢測固定化酶的機械性能和操作穩定性.固定化酶的操作穩定性如圖10所示.從圖10可以看出，固定化酶經連續使用6次后，酶活保留60%，固定化酶顆粒完整，顯示了良好的重復利用率.

4 結論

通過制備PVA-SA復合載體共固定化GOD和CAT，優化了制備工藝，研究了固定化酶與游離酶酶學性質.得到如下結論：制備固定化酶的條件為復合載體比例PVA∶SA＝9.0∶1.5，酶活之比CAT∶GOD＝10∶1，加酶量為10 mg／m L；固定化酶的最適反應溫度為45℃，最適反應p H 6.0，Km值由10.96變為6.81，Vmax由57.5μmol／L變為71.3μmol／L，提高24%；固定化酶連續使用6次酶活保留60%；GOD和CAT共固定化后，耐酸和熱穩定性等理化參數比游離酶有較大幅度提升，使用條件更加靈活，應用范圍增廣，具有一定的現實意義.

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