一株產漆酶真菌的篩選、鑒定及發酵研究

陳守菊，李 松，陳阿娜，湯文晶，劉 宇，湯 斌

（安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000）

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）最早發現于日本紫膠漆樹Rhusvernicifera的浸出液中，是一種含銅的多酚氧化酶，能夠在氧氣作為電子受體的條件下氧化芳香族化合物，且可催化的底物非常廣泛.隨后，幾乎在所有已研究的木腐真菌中均有發現，同時也存在于部分植物、細菌和昆蟲之中[1].隨著漆酶的發現和深入研究，在某些小分子化合物作為介體存在的條件下，漆酶還能夠氧化非酚型木質素結構.漆酶對木質素以及與木質素結構相似的許多環境污染物的降解作用越來越受到人們的重視[2].在紙漿去木質化[3]、有機染料脫色[4]、紡織污水處理[5]、生物傳感器[6]、食品飲料行業[7]、有機合成[8-10]、藥物合成[11]、醫療診斷和作為抗癌藥物制備的催化劑[12]、生物防治[13]、生物能源[14-15]等方面，表現出了重要的研究價值和應用潛力，因而日益受到重視.

已報道文獻指出，高等真菌尤其是擔子菌中的白腐真菌[16]（White-rot fungi）是目前最有效的漆酶產生菌種之一.但是從漆酶生產工業化應用的角度出發，目前研究的漆酶產生菌株仍具有發酵產酶時間長或發酵活力較低等缺點，仍不適用于漆酶的大規模工業化生產，在一定程度上限制了漆酶的廣泛應用.因此，為了更好地滿足生產需求，篩選具有發酵時間短及發酵活力高等特點的漆酶產生菌株依然是一個長遠而艱巨的研究任務.本文采用愈創木酚顯色法[17]對多個自然樣本進行篩選，獲得一株發酵時間較短的漆酶產生菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

（1）篩選樣本.分離樣本采集于安徽省蕪湖市神山公園、赭山公園和清水苗圃園等富含腐爛植物莖葉組織的土壤.

（2）培養基.PDA 培養基（g／L）：葡萄糖20，土豆（浸出汁）200，瓊脂粉15，p H 值自然.篩選培養基：PDA培養基添加愈創木酚（0.04%）及卡那霉素（50 mg／L）.種子培養基（g／L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉3，p H值自然.基本發酵產酶培養基（g／L）：葡萄糖20，酒石酸銨8，KH2PO42，MgSO4·7 H2O 0.6，CaCl2·2 H2O 0.8，CuSO4·5H2O 0.25，Tween80 0.25，p H 6.0.

（3）主要試劑與儀器.工具酶、PCR產物回收、純化等DNA操作試劑盒、抗生素和愈創木酚等購自生工生物工程（上海）股份有限公司和寶生物工程（大連）有限公司.其他化學試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品.麩皮、豆粕、玉米粉和豆渣等生物原材料為市購.

Allg64R高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；S1000 Bio-Rad PCR儀（美國伯樂Bio-rad）；S-4800高分辨率場發射掃描電鏡（日本日立公司）；FD8-3真空冷凍干燥機（美國SIM公司）；雷磁PHS-3E p H計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；GHZ-123B恒溫培養箱（太倉市華美生化儀器廠）.

1.2 方法

（1）產漆酶真菌的篩選.將采集的樣本在無菌環境中進行打碎并進行梯度稀釋.分別取200μL各樣本梯度稀釋液涂布于篩選平板，30℃條件下恒溫培養3～4 d后挑取具有紅褐色氧化圈的菌落進行分離和純化.在完全相同的培養條件下，挑取在一定時間內產生紅褐色氧化圈較大的菌株進行復篩和后續實驗.

（2）漆酶產生菌株的顯微形態觀察.將在平板上出現氧化圈較大的漆酶產生菌株在30℃下恒溫培養4 d，形成巨大菌落，取菌絲制片，分別進行光學顯微鏡和掃描電鏡觀察，以研究菌絲及孢子形態特征.

（3）漆酶產生菌株的分子生物學鑒定.分離菌株染色體DNA的提取、質粒DNA的小量制備及DNA的酶切、連接、轉化等分子操作及SDS-PAGE：參見《分子克隆實驗指南》（第二版）進行.其中，以CTAB抽提法獲得的該菌株染色體DNA為模板，以5.8 S r DNA-ITS區域通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為擴增引物，使用PCR方法獲得該菌株5.8 S r DNA-ITS片段并測序，序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成.通過在線數據庫Blast／blastp（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Blast）對測定序列進行比對，并使用 MEGA 5.1軟件通過Neighbor-Joining（NJ）法構建系統發育樹.

（4）發酵種子液的制備.菌種在PDA培養基中培養3 d后用無菌水洗下孢子，使用血球計數板計算孢子數并稀釋至1×107個／m L.按1%接種量接入裝液量20%（250 m L三角瓶）種子培養基，于30℃、200 r／min條件下培養24 h后作為種子液備用.

（5）漆酶搖瓶發酵條件優化.改變基本發酵產酶培養基中的碳源、氮源、初始p H值等條件以研究單因素對菌種產漆酶的影響.確定較優的單因素后利用正交設計方法對單因素進行組合優化.發酵條件：發酵液裝液量為20%（250 m L三角瓶），初始p H為6.0，接種量為10%，溫度和轉速分別為30℃和200 r／min.發酵至不同時間取樣并于12 000 r／min離心5 min，取上清進行酶活力測定.

（6）酶活力測定.采用 ABTS法測定漆酶酶活[18].取1.5 m L 0.5 m M ABTS底物溶液（溶解于0.1 M，p H 4.0的醋酸／醋酸鈉緩沖液）與1.5 m L適當稀釋的酶液在40℃進行反應，測定反應前3 min內420 nm處吸光值的變化.定義1 min內氧化1μmol ABTS所需要的酶量為一個漆酶活力單位（U）.

（7）漆酶的反應動力學參數.以ABTS為底物，改變底物添加量（20μL、32μL、50μL、100μL、200μL、500μL），在最適溫度和最適p H的條件下測定漆酶活力，按照Lineweaver-Burk作圖法制作雙倒數圖.由直線的截距計算Vmax和Km.

2 結果與分析

2.1 產漆酶菌株篩選

在27個自然樣本的篩選平板中共得到2個可產生紅褐色氧化圈且菌落形態具有明顯差異的菌株，可能均是潛在的漆酶產生菌株.其中，在第10號樣本中得到的菌株生長較快且所產氧化圈較大，將該菌株命名為LS-10.挑取菌株LS-10進行培養并觀察其巨大菌落和顯微形態，如圖1所示.該菌株在PDA平板上生長較快，菌落開始呈白色、致密、圓形、向四周擴展，后從菌落中央產生綠色孢子，中央變成綠色，菌落周圍有白色菌絲生長帶.菌絲纖細，寬度約1.0～2.0μm，產生分生孢子.孢子簇生，呈不規則橢圓形，有凹，直徑約4μm.根據形態學觀察結果初步將LS-10鑒定為木霉屬微生物.

菌株在篩選培養基中產生紅褐色氧化帶正面照片如圖1a所示；菌株在篩選培養基中產生紅褐色氧化帶背面照片如圖1b所示；菌株在PDA培養基中的巨大菌落如圖1c所示；菌絲光學顯微鏡觀察形態（400倍）如圖1d所示；菌株分生孢子梗形態（SEM 3500倍）如圖1e所示；分生孢子形態（SEM 25000倍）如圖1f所示.

2.2 產漆酶菌株分子生物學鑒定

將LS-10菌株的5.8 S r DNA-ITS序列測定結果與GenBank中已登錄的序列進行Blast比對，選擇同源性較高的菌株序列進行分析，使用MEGA5.1軟件中的Neighbor-Joining程序構建系統進化樹，如圖2所示.由圖2可知，該菌株與棘孢木霉Trichodermaasperellum的相似性較高，結合形態學鑒定結果，將該菌株鑒定為棘孢木霉，并命名為棘孢木霉LS-10.

2.3 產漆酶條件單因素試驗

（1）發酵時間對產酶的影響.使用基本發酵產酶培養基將篩選獲得的菌株LS-10在30℃、200 r／min的條件下培養，期間取樣并測定漆酶活力，菌株LS-10發酵產漆酶過程如圖3所示.由圖3可知，該菌株在24～48 h內產酶速率較快，并在48 h時達到最大產酶水平，但48 h后發酵液中漆酶水平會急劇下降，因此初步確定該菌株的最佳發酵產酶時間為48 h.

（2）不同碳源對產酶的影響.分別以2%的葡萄糖、蔗糖、半乳糖等作為碳源進行發酵培養，并測定漆酶活力，結果如圖4所示.由圖4可知，該菌株以麩皮汁、蔗糖和半乳糖為碳源時產酶水平較高.從發酵原料成本方面考慮，本研究選擇麩皮汁作為最佳碳源進行后續研究.研究發現該菌株LS-10利用10%的麩皮汁作為單一碳源產生漆酶水平較高，如圖5所示.

（3）不同氮源對產酶的影響.以10%的麩皮汁作為碳源，分別以1%的硫酸銨、酒石酸銨、蛋白胨等作為單一氮源發酵產漆酶，結果如圖6所示.由圖6可知，該菌株LS-10分別以酒石酸銨、豆粕和蛋白胨為單一氮源時產酶水平較高.

（4）不同初始p H對產酶的影響.使用0.1%磷酸緩沖液將發酵培養基調至不同p H值進行發酵，結果如圖7所示.由圖7可知，該菌株在發酵液初始p H 5.5～6.5之間產漆酶水平較高，在較低p H和較高p H范圍內產酶水平會急劇下降，表明該菌株LS-10產漆酶能力對p H值較為敏感.

（5）不同Cu2＋濃度對產酶的影響.Cu2＋濃度對菌株LS-10發酵產漆酶的影響如圖8所示.由圖8可知，一定濃度的Cu2＋對該菌株LS-10產漆酶具有促進作用.銅離子濃度低于1 m M時，漆酶產生水平隨著Cu2＋的增加而提高，但當Cu2＋濃度高于2 m M時將對該菌株的漆酶產生水平造成強烈的抑制作用.其中，在高濃度Cu2＋（4 m M）條件下，發酵液中菌絲生長受到抑制，菌體得率明顯下降，可能是由于高濃度的Cu2＋對菌體生長產生毒害作用，從而降低了該菌株的發酵產漆酶水平.

2.4 發酵培養基碳氮源組合優化

為綜合考察碳源和氮源對該菌株LS-10產漆酶的影響，研究中進一步選取蔗糖、麩皮汁、酒石酸銨和豆粕等4個因素進行3個水平的正交優化試驗.選擇L9（34）正交表進行水平組合處理設計，正交試驗數據分析如圖9所示，其中A、B、C和D分別代表蔗糖、麩皮汁、酒石酸銨和豆粕.由圖9可知，在所設定的試驗條件下，碳氮源的最優組合是A3B1C2D2，即：蔗糖25 g／L、麩皮汁80 g／L、酒石酸銨10 g／L和豆粕18 g／L時，最高酶活力達到571.32 U／L.其中，碳源濃度的變化對該菌株產漆酶影響較大，可能是該菌種發酵產酶過程中的關鍵影響因素.

2.5 漆酶的反應動力學參數

Km是酶的一個重要特征，反應了酶同底物的親和力大小.本實驗以ABTS為底物，在最適溫度和最適p H條件下，測定該酶在不同底物濃度時的酶活，按照Line weaver-Burk作圖，結果如圖10所示.計算出Vmax＝3.68 m M／min和Km＝0.018 m M，動力學分析表明該酶與底物的親和力較大.

3 討論

通過愈創木酚顯色法，從土壤中篩選到一株快速產漆酶的絲狀真菌，結合形態學和分子生物學方法鑒定，確定所篩菌株為棘孢木霉.逐步利用單因素試驗及正交試驗對該菌株的發酵進行優化，確定該菌株產漆酶最佳發酵培養基和發酵條件.碳源是菌體碳架及能量的來源，不同菌株生長和產酶的最適碳源也大都不同.白腐菌的最佳碳源主要有麩皮、蔗糖、葡萄糖及麥芽糖等，最佳氮源主要有豆粕、酵母粉、蛋白胨、硝酸銨及酒石酸銨等[19].研究發現該菌株以麩皮汁、蔗糖和半乳糖為碳源時產酶水平較高，以酒石酸銨、豆粕和蛋白胨為單一氮源時產酶水平較高，都與白腐菌的最適碳氮源相似.其中，碳源濃度的變化對該菌株產漆酶影響較大，可能是該菌種發酵產酶過程中的關鍵影響因素.

培養基初始p H直接影響到菌株生長和產酶活動，有大量研究資料表明，真菌產漆酶的最適p H通常為弱酸性.該菌株產漆酶對初始p H比較敏感，在弱酸性p H（5.5～6.5）條件下較利于漆酶表達，而過高或過低的p H均不利于漆酶的產生.同時研究發現，不加銅離子時，發酵液中幾乎檢測不到酶活，低濃度的銅離子（1 m M）對該菌株產酶具有顯著的促進作用，而高濃度的銅離子則有強烈的抑制作用，這表明了銅離子作為漆酶的催化活性中心，在發酵產漆酶的過程中是不可或缺的.綜上，研究中確定該菌株最佳的產酶條件為（g／L）：蔗糖25，麩皮汁80，酒石酸銨10，豆粕18，1 m M Cu2＋，p H 5.5～6.5時，漆酶最高酶活力達到571.32 U／L，高于之前已經報道的棘孢木霉最高漆酶酶活500 U／L.研究結果表明，對棘孢木霉產酶條件進行的優化是有效的，且動力學分析表明，該酶與底物的親和力較大，這為漆酶的實際應用提供了有價值的參考信息.

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