降解甲醛的假單胞菌菌株的固定化研究

高 勇，顧 銳，汪令翔，孔 芳，蔡為榮

（安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000）

固定化微生物技術(shù)是指通過物理或化學手段，將游離微生物細胞固定于限定的空間載體上，使其高密度并保持生物活性，在適宜條件下可以增殖、反復利用的生物技術(shù).固定化微生物技術(shù)與傳統(tǒng)的生物處理方法相比，具有微生物生物濃度易控制、抗（耐）毒性能力強、微生物菌種流失少、反應(yīng)過程易調(diào)控及效率高等優(yōu)點[6-8].本研究以采集的印染廠長期浸泡的活性污泥中篩選到的一株可快速降解甲醛的菌株 W1作為出發(fā)菌株，采用海藻酸鈉法對菌株W1進行固定化包埋處理，研究合適的固定化條件，并以甲醛降解率為試驗指標設(shè)計正交優(yōu)化，研究各因素對固定化菌株降解甲醛的影響，為生物法去除甲醛的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從安徽蕪湖中天印染廠長期浸泡的活性污泥中篩選得到的降解甲醛的菌株W1，由安徽工程大學生物與化學工程學院生技實驗室提供.

1.2 試劑與儀器

乙酰丙酮，海藻酸鈉，甲醛液體，冰醋酸均系上海國藥集團化學試劑有限公司提供，試劑均為分析純.

TGL-16G高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV-2100分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；HH-2、HH-6（金壇市杰瑞爾電器有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋）；BS-1EA數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海本波儀器有限公司）；SW-CJ-2FD（蘇州凈化設(shè)備有限公司雙人單面超凈工作臺）.

1.3 培養(yǎng)基配制

優(yōu)化降解培養(yǎng)基（g／L）：K2HPO43.0，KH2PO44.0，MgSO4·7 H2O 0.2，蛋白胨1.2，微量元素母液0.1 m L，調(diào)p H 8.0～9.0，0.68×105Pa滅菌30 min.

無機鹽培養(yǎng)基（g／L）：MgSO4·7H2O 0.2，（NH4）2SO42.4，微量元素母液0.1 m L，調(diào)p H 8.0，0.68×105Pa滅菌30 min.

蛋白胨培養(yǎng)基（g／L）：蛋白胨3.0，NaCl 10.0，調(diào)p H 7.0，0.68×105Pa滅菌30 min.

根據(jù)備忘錄，雙方將在核工業(yè)的制造、工程和技術(shù)服務(wù)領(lǐng)域以及用于下一代商業(yè)反應(yīng)堆的先進技術(shù)領(lǐng)域開展合作。尤其是，雙方準備在下一代反應(yīng)堆研發(fā)領(lǐng)域開展合作。

乙酰丙酮溶液（g／100 m L）：乙酸銨50 g、6 m L冰醋酸及0.5 m L乙酰丙酮試劑溶于100 m L dd H2O水中，4℃冰箱保存.

微量元素母液（g／L）：H3BO36.0，ZnSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 4.0，Na2MoO4·7H2O 0.6，MnCl2·4H2O 0.6，NiCl2·6H2O 0.4，CuCl2·2H2O 0.2.

1.4 實驗方法

（1）甲醛的檢測方法.甲醛的檢測參照GB／T 13197-1991的乙酰丙酮分光光度法[9].將10.8 mg／m L甲醛標準溶液稀釋至10.8μg／m L取數(shù)支25 m L具塞刻度管，分別加入1～8 m L甲醛標準使用溶液，用dd H2O稀釋至刻度線后，各加入2.5 m L乙酰丙酮溶液，顛倒數(shù)次使其混勻，60℃水浴15 min，取出室溫冷卻1 h后在波長414 nm處，以dd H2O為參比測量吸光度，減去空白試驗所測得的吸光度，得到校準值，以甲醛量（μg）為橫坐標，校準值為縱坐標，繪制甲醛標準曲線.

（2）菌種的活化.將菌株W1接種于LB斜面上培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水將斜面上的菌苔沖洗下來，震蕩至菌體分散均勻，配制菌懸液，將其分裝于優(yōu)化的降解培養(yǎng)基中，并加入適量甲醛溶液，150 r／min和30℃搖床振蕩培養(yǎng)，進行菌種活化.

（3）固定化顆粒的制備.包埋顆粒：將菌株W1活化至對數(shù)生長后期，在4℃下以2000×g離心7 min，去上清，菌體用0.9%生理鹽水反復洗滌2～3次，將菌體用生理鹽水配制成菌懸液，無菌條件下與4%的海藻酸鈉溶液以1∶1（V／V）混合，攪拌混勻，制成細菌-海藻酸鈉混合液，滴入4%的CaCl2溶液中形成海藻酸鈉凝膠微球，靜置固化2 h，將成型的凝膠微球取出保存于無菌生理鹽水中，置于4℃冰箱中過夜充分固定.空白顆粒對照是以不加菌體的0.9%的生理鹽水以如上方法配制而成.

（4）菌體固定化后的甲醛降解效果.

①蛋白胨水培養(yǎng)基與生理鹽水對固定化顆粒降解甲醛的效果比較.以一定菌液濃度制成的包埋顆粒做實驗組，空白組中加入與包埋顆粒等量的空白顆粒，每組設(shè)置3個平行，將錐形瓶置于30℃，150 r／min恒溫搖床培養(yǎng)，間隔一定時間取樣，參照乙酰丙酮法測定甲醛質(zhì)量濃度，繪制反應(yīng)過程中甲醛降解曲線圖.

②無機鹽培養(yǎng)基與生理鹽水對固定化顆粒降解甲醛的效果比較.根據(jù)出發(fā)菌株的最適p H生長條件，調(diào)節(jié)生理鹽水的p H值至8.0.實驗組中加入一定量含菌包埋顆粒，空白組中加入與包埋顆粒等量的空白顆粒.將錐形瓶置于30℃、150 r／min恒溫搖床培養(yǎng)，間隔一定時間取樣，參照乙酰丙酮法測定甲醛質(zhì)量濃度，繪制反應(yīng)過程中甲醛降解曲線圖.

（5）固定化菌株在不同溫度下的甲醛降解效果.將優(yōu)化降解培養(yǎng)基培養(yǎng)活化至對數(shù)生長期的出發(fā)菌株W1，2000×g離心7 min后去上清，加滅菌生理鹽水洗滌2～3次.隨后制成菌懸液，加入到4%的CaCl2溶液中制成固定化顆粒，加入1 g／L甲醛溶液.將實驗組與對照組分別置于不同溫度（25℃，30℃，37℃），轉(zhuǎn)速均為150 r／min的搖床中培養(yǎng).隔一定時間取樣，用乙酰丙酮法測定甲醛質(zhì)量濃度.

（6）固定化菌株在不同p H下的甲醛降解效果.配制p H分別為7、8、9、10、11的6種不同的無機鹽培養(yǎng)基，由1.4（5）中同樣方法進行設(shè)置平行實驗及對照組，隔一定時間取樣，乙酰丙酮法測定甲醛質(zhì)量濃度.

（7）正交試驗.本試驗選用L9（33）正交設(shè)計表在3個水平上對培養(yǎng)基類別、p H值、培養(yǎng)溫度3個因素進行分析，以甲醛降解率為測定指標，考察多因素的綜合影響.其因素與水平設(shè)計如表1所示.

表1 固定化后處理甲醛的3因素3水平正交試驗

表1 固定化后處理甲醛的3因素3水平正交試驗

水平（Levels） 培養(yǎng)基類別A p H值B 溫度C（℃）1無機鹽培養(yǎng)基 8 25 2蛋白胨水培養(yǎng)基 9 30 3生理鹽水 10 37

甲醛降解率的計算公式：

式中，A 為降解前的甲醛含量（g／L）；B 為降解后的甲醛含量（g／L）.

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛標準曲線的繪制

以甲醛含量為橫坐標，校正吸光值為縱坐標，繪制出甲醛校正曲線如圖1所示.由圖1可知，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 3，因此接下來實驗中要測定樣品中的甲醛含量，只需將樣品稀釋到適當濃度，測定其在414 nm處的吸光值，減去空白試驗吸光值，將校正吸光值對照校準曲線便可求得樣品中的甲醛濃度.

2.2 菌體固定化后的甲醛降解效果

菌體固定化后的甲醛降解過程如圖2所示.由圖2可知，隨著處理時間的延長，加入含菌液的固定化顆粒的培養(yǎng)基中甲醛質(zhì)量濃度呈明顯下降趨勢，而對照組中的甲醛質(zhì)量濃度則基本保持不變.由此可見，培養(yǎng)基中甲醛含量的減少是由于固定化細胞降解的結(jié)果，而固定化顆粒本身對甲醛并無吸附作用，實驗組中固定化顆粒有較好的甲醛降解效果，24 h甲醛去除率達到64.70%.

2.3 蛋白胨水培養(yǎng)基與生理鹽水對固定化顆粒降解甲醛的效果比較

固定化細胞在蛋白胨水培養(yǎng)基與在生理鹽水中對甲醛的降解過程如圖3所示.由圖3可知，固定化細胞在前者中的甲醛降解能力明顯高于后者，且前者中固定化細胞降解甲醛可以持續(xù)至48 h，對應(yīng)的甲醛去除率可達66.0%，而后者中的甲醛去除率僅在30.8%左右，且此后基本處于平衡狀態(tài).

2.4 無機鹽培養(yǎng)基與生理鹽水對固定化顆粒降解甲醛的效果比較

固定化細胞在p H 8.0的無機鹽培養(yǎng)基和生理鹽水中對甲醛的降解過程如圖4所示.由圖4可知，在p H 8.0的無機鹽培養(yǎng)基中，甲醛質(zhì)量濃度的降解量明顯高于在生理鹽水中.結(jié)果顯示48 h內(nèi)，前者培養(yǎng)基中的甲醛去除率76.80%，而后者甲醛去除率為31.0%，并且無機鹽培養(yǎng)基更符合降解外界條件，且固定化細胞在此培養(yǎng)基中有較高的甲醛去除率.

2.5 固定化菌株在不同溫度下的甲醛降解效果

實驗設(shè)置3個溫度（25℃，30℃和37℃）對固定化細胞振蕩培養(yǎng)，對甲醛的降解過程如圖5所示.由圖5可知，在48 h內(nèi)，37℃培養(yǎng)條件下的固定化細胞的甲醛降解效率最低，僅為48.5%；而30℃條件下的固定化細胞的甲醛降解效率最高，達到80.3%；25℃條件下的固定化細胞的甲醛降解效率介于二者之間，為72.3%.

2.6 固定化菌株在不同p H下的甲醛降解效果

固定化菌株在不同p H下的甲醛降解效果如圖6所示.由圖6可知，p H值不同對固定化細胞的甲醛降解效果有較大差異，而空白組中甲醛去除率較小.在24 h內(nèi)，p H值為7、8、9、10、11的磷酸緩沖液中甲醛的去除率分別為29.5%、76.8%、80.3%、71.3%、67.5%.其中p H 為9時，固定化細胞的24 h內(nèi)甲醛降解效果最好，達到80.3%.

2.7 正交試驗

固定化后處理甲醛3因素3水平正交試驗及方差分析如表2、表3所示.

由表2的正交試驗極差分析可知，各因素對試驗影響的主次順序為：A（培養(yǎng)基類別）＞C（溫度）＞B（p H）.最佳工藝條件組合為A1B2C2，即固定化細胞甲醛降解的最適環(huán)境為：溫度30℃，培養(yǎng)基為MgSO4·7 H2O 0.2 g／L，（NH4）2SO42.4 g／L，微量元素母液0.1 m L，p H 值9.在該條件下，甲醛48 h內(nèi)的降解效率高達80.3%.

由表3方差分析表的F值可以得出培養(yǎng)基類別、p H值、溫度對甲醛降解效果影響的顯著性.對試驗結(jié)果的影響程度是：培養(yǎng)基類別＞溫度＞p H，因此，在影響甲醛降解效果的3個因素中，培養(yǎng)基類別對甲醛降解效果有顯著影響，溫度、p H無顯著影響.

表2 固定化后處理甲醛3因素3水平L 9（33）正交試驗

表3 方差分析表

3 結(jié)論

通過對實驗室篩選出的耐受甲醛降解菌株P(guān)seudomonas putida W1進行固定化研究發(fā)現(xiàn)，以海藻酸鈉為包埋載體，固定化細胞Pseudomonas putida W1有良好的甲醛降解效率.溫度及p H可有效提高固定化細胞對甲醛降解的效率，但均需在一定的合適范圍內(nèi).固定化細胞甲醛降解的最佳條件為：溫度30℃，培養(yǎng)基為 MgSO4·7H2O 0.2g／L，（NH4）2SO42.4 g／L，p H 9.在該條件下，甲醛48 h內(nèi)的降解效率高達80.3%.該固定化細胞顆粒可應(yīng)用于降解甲醛的反應(yīng)器中，為生物法降解甲醛奠定基礎(chǔ).

[1]D Yu，L Song，W Wang，etal.Isolation and characterization of formaldehyde-degrading fungi and its formaldehyde metabolism[J].Environ Sci Pollut Res Int.，2014，21（9）：6 016-6 024.

[2]Fukuda R，Nagahama K，F(xiàn)ukuda K，etal.Purification and properties of S-hydroxy methylglutathione dehydrogenase of Paecilomyces variotii no.5，a formaldehyde-degrading fungus[J].AMB Express.，2012，2（1）：32.

[3]孔芳，郭鳳獻，吳木章.一株甲醛降解菌的篩選及降解特性的研究[J].微生物學通報，2014，41（6）：1244-1251.

[4]李晶平，魯統(tǒng)布，陸慧玲.甲醛毒性及其常用檢測方法[J].中山大學研究生學刊：自然科學、醫(yī)學版，2006，26（1）：34-38.

[5]S Huang，N Chen，Y Zheng，etal.Metabolic characteristics of carbon sources of three strains by formaldehyde-degrading fungi[J].China Environ Sci.，2009，29：1 239-1 242.

[6]李端林，盧徐節(jié).固定化微生物技術(shù)在印染廢水處理中的應(yīng)用[J].江漢大學學報：自然科學版，2013，41（1）：51-54.

[7]黃川，王里奧，崔志強.采用海藻酸鈉固定化微生物技術(shù)處理甲醇廢水[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，24（7）：78-81.

[8]Di Maiuta N，Hubschmid S，Giuliani N，etal.Microbial degradation of formaldehyde in white mineral dispersions preserved with formaldehyde-releasing biocides[J].Int Biodeterior Biodegrad，2009，63：769-777.

[9]劉曉林，吳小峰，劉保鋒.GB13197-1991，水質(zhì)甲醛的測定乙酰丙酮分光光度法改進淺述[J].艦船防化，2011（4）：42-44.