糖皮質激素受體基因多態性與大皰性類天皰瘡糖皮質激素抵抗的相關性研究

王德全王玉國陳宗燕劉保國苗國英張合恩吳 平姜 斌

糖皮質激素受體基因多態性與大皰性類天皰瘡糖皮質激素抵抗的相關性研究

王德全1王玉國2陳宗燕2劉保國3?苗國英3張合恩3吳 平3姜 斌3

目的: 檢測糖皮質激素受體基因多態位點(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)，明確其與大皰性類天皰瘡糖皮質激素(以下簡稱激素)抵抗的相關性。方法: 提取激素敏感組(40例)、激素抵抗組(48例)及健康對照組(42名)外周血DNA，應用SNaPshotSNP分型技術進行GR基因多態性位點(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)檢測。結果: 激素敏感組、激素抵抗組和健康對照組均檢出BclI有3種基因型CC、CG、GG，差異無統計學意義(P＞0.05)；N363S、ER22/23EK、9β基因位點不存在多態性。結論: GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β多態性與BP激素抵抗可能無相關性。

糖皮質激素受體； 基因多態性； 大皰性類天皰瘡

大皰性類天皰瘡(BP)是一個好發于老年人的大皰性皮膚病。患者病情較重，臨床上以軀干、四肢出現張力性大皰為主要特點，黏膜損傷較為少見。1糖皮質激素是治療大皰性類天皰瘡(BP)的首選藥物。糖皮質激素(glucocorticoid，GC，簡稱為激素)的效應由糖皮質激素受體(GR)介導實現，然而GC治療存在個體差異，甚至出現治療抵抗。有研究報道，2，3糖皮質激素受體基因多態性對GR功能產生影響，被認為是GC抵抗的重要分子機制之一。本研究通過分析糖皮質激素受體(GR)基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β單核苷酸多態性(SNP)，探討其與大皰性類天皰瘡激素抵抗的相關性，為闡明激素抵抗形成機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 臨床診斷參照《中國臨床皮膚病學》和《皮膚性病學》制定的BP診斷標準，主要根據病史、臨床表現、組織病理及免疫熒光病理確診。4回顧既往病案，據患者病情輕重，GC治療量相當于潑尼松0.5～1.0 mg/(kg·d)，1周內病情得到控制，列入激素敏感組，如1周內病情未控制，則在原有劑量的基礎上增加50%，如果1.5 mg/(kg·d)仍未能控制病情，則該患者列入激素抵抗組，如果患者控制病情的GC用量≤1.5 mg/(kg·d)，則列入激素治療敏感組。激素敏感型類天皰瘡患者40例、激素抵抗型類天皰瘡患者48例。外周血標本取自河北工程大學附屬醫院2006年1月至2013年12月皮膚科門診及住院患者，健康對照組42例外周血標本采自河北工程大學附屬

醫院健康體檢者，無自身免疫性疾病病史。各組研究對象均為河北籍漢族。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 從患者外周血提取基因組DNA，抽提方法參照試劑盒(DP318離心柱型，北京TIANGEN公司)說明書進行操作，DNA樣品置于－20℃保存。

1.2.2 引物設計 在Pubmed SNP入口檢索GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β的SNP位點相關信息，并參考文獻資料，5使用Primer 5.0引物設計軟件設計引物，引物序列見表1。

1.2.3 PCR擴增目的基因 使用1管便攜式PCR擴增試劑/2×Taq PCR MasterMiX/KT201－01(北京TIANGEN公司)。PCR反應條件:95℃變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，共進行42個循環，72℃延伸5 min。PCR操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物 取混勻的PCR產物6μL點樣，陰性對照上樣量為10μL，每點樣一次均換槍頭，避免污染產物。在本次的電泳圖中，所使用的marker均為DL2000 marker(條帶由下至上分別為100 250 500 750 1000 2000，圖1)。

1.2.5 PCR產物序列分析 純化后的PCR產物經酶消化后，送北京金維智公司進行測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計算各組各位點基因型分布頻率及等位基因頻率，確認其符合Hardy－Weinberg平衡。各組間等位基因和基因型比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組基因位點遺傳平衡檢驗 對敏感組、抵抗組和對照組4個SNP位點(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)分別進行Hardy－Weinberg平衡吻合度檢驗，結果均P＞0.05，說明敏感組、抵抗組和對照組均符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，數據來自同一孟德爾群體，具有群體代表性。

2.2 GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β多態性位點DNA片段測序圖 敏感組、抵抗組和對照組均檢出BclI(rs41423247)IVS1184＋646位點存在C→G的堿基變異(實驗組測序圖見圖2)。N363S、ER22/ 23EK、9β3個基因位點未檢出堿基變異。

表1 4個基因位點PCR引物序列

圖1 瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴增產物

圖2 實驗組BclI位點基因突變測序圖(紅框所示為基因突變位點)

2.3 GR基因型的分布及等位基因頻率 BclI的3種基因型(CC、CG、GG)在敏感組、抵抗組和對照組中的分布如表2，經χ2檢驗，差異無統計學意義(P＝0.886)。3組BclI等位基因G、C在敏感組頻率分別為19%和81%，在抵抗組分別為26%和74%，在對照組分別為22%和78%，3組之間差異無統計學意義(P＝0.962)。N363S、ER22/23EK、9β基因位點僅檢出一種基因型，分別為AA、GG、AA，基因分布頻率在敏感組、抵抗組和對照組均為100%，差異無統計學意義(χ2＝0，P＞0.05)，見表3。

表2 3組BclI位點基因型和等位基因頻率比較

表3 2組N363S、ER22、9β位點基因型和等位基因頻率比較

3 討論

隨著人類基因組圖譜繪制的日益完善，其中蘊含著眾多單核苷酸多態性(SNPs)已受到分子生物學研究者的普遍關注和研究。因為SNPs是用以確定候選基因的新一代遺傳標記，有助于發現人類的一些復雜疾病相關基因。另外，也越來越多地用來探討同一基因、不同基因的SNPs連鎖關系，及其與疾病易感性、致病性等關系。

研究表明，糖皮質激素受體基因存在多個多態性基因位點，其中包括N363S、ER22/23EK、BclI、9β、 D641V等，突變可導致基因轉錄活性喪失或下降、一些多態性基因蛋白表達產物活性降低甚至不具有生物活性等，最終導致受體表達數量降低或受體親和力下降。6，7因此，GR基因多態性與激素抵抗現象很可能有關。

N363S多態性是位于GR基因2號外顯子上，N363S多態性是指野生型的1220位上的堿基A被G替代，其編碼363號氨基酸由天冬酰胺變成絲氨酸，絲氨酸殘基可以提供磷酸化位點，高度磷酸化的GR基因表達增強，因而提高了GR對糖皮質激素的敏感

性。8有報道稱相比正常的GR，N363S能夠調節一些新的基因，其產生的影響可能提高GC的敏感性，但具體機制至今尚未十分清楚。9對于該多態性與疾病的關系，國內外學者已進行了很多研究，主要集中在與代謝性疾病和心血管疾病的關系上。而對于N363S多態性與 BP的研究甚少。本研究對3組N363S基因多態性進行篩查發現，敏感組、抵抗組和對照組均未發現N363S存在多態性，基因型均為AA，表明GR基因N363S多態性與BP激素抵抗可能無明顯相關性。

ER22/23EK多態性位于GR基因2號外顯子上，是22號和23號密碼子上兩個連鎖的單核苷酸突變，其中22號密碼子上突變(GAG突變為GAA)不會引起氨基酸改變均編碼谷氨酸，但是后一個突變(AGG突變為AAG)使精氨酸變成賴氨酸。10這兩種多態性變化改變了受體表達和功能，從而影響了疾病易感性及臨床表現多樣性，對GC療效也有一定程度的影響。本研究對3組ER22/23EK多態性的檢測結果顯示:基因型均為GG，無突變型存在，從而表明與BP抵抗無相關性。

BclI多態性是指位于在GR基因2號外顯子下游646位點處有一突變:C→G，可能產生2.2 kb和3.9 kb長度的兩個片段。11文獻報道中，與臨床關聯最多的人類糖皮質激素基因(nuclear receptor superfamily3，groupC，member1，NR3Cl)的多態性位點就是BclI，該位點存在CC、CG、GG 3種基因型。通過影響GR來提高糖皮質激素(GC)的敏感性，由于BclI多態性在內含子，既不與編碼氨基酸的密碼子有關，也不與基因的調節和斷裂點有關，故糖皮質激素治療BP產生激素抵抗及耐藥機制尚不清楚，可能是因位于基因編碼的起始區，或者與某個具有功能的重要多態性相連等。12研究發現，敏感組、抵抗組和對照組BclI位點基因型分布差異無統計學意義，3組人群等位基因C所占比例均為80%左右，提示可能存在種族特異性。國內對BclI基因多態性與BP激素抵抗的研究較少，本研究雖得出陰性結果，但仍需在更大樣本人群中進行重復研究及對BclI基因多態性與BP治療反應性進行相關性研究。

9β是GR外顯子9β上ATTTA→GTTTA，A→G的核苷酸突變導致GRβmRNA轉錄增多，抑制GRa與激素的結合，從而降低細胞對激素的敏感性，導致激素耐受。南亞人群中該等位基因G的頻率為0.166，與歐洲人群篩查結果相同。13目前在中國人群中對該位點的臨床意義尚無相關研究。本研究顯示，該位點僅發現基因型AA，未發現其他等位基因，與BP激素抵抗無明顯相關性。

此次研究未能發現BP與GR基因N363S、ER22/ 23EK、BclI、9β位點SNP相關性，分析原因可能是: (1)GR基因可能與BP激素抵抗相關性較低。(2)本研究尚有自身局限性，只選取了GR基因的4個位點，研究范圍較窄，GR基因其他位點多態性與BP激素抵抗關系還有待進一步探討。(3)未發現N363S、ER22/23EK、9β多態性存在，說明這3個位點在漢族人群中突變率較低，甚至可能不存在突變。本文只是對GR基因多態性與BP激素抵抗的初步研究，對于GR基因多態性與GC治療療效的關系還有待進一步探討。該研究可能由于樣本量小，其確切結論尚需擴大樣本量進一步研究。

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(收稿:2014－09－19 修回:2014－11－06)

Correlation between glucocorticoid recep tor gene polymorphism and glucocorticoid resistance in the patients w ith bullous pem phigus

WANG De-quan，WANG Yu-guo，CHEN Zong-yan，et al.Chengde Medical College，Chengde，067000

Objective:To detect the genotype frequency of polymorphic loci(N363S，ER22/23EK，BclI，9β)of glucocorticoid receptor(GR)gene to determine the correlation between glucocorticoid receptor gene polymorphism and glucocorticoid resistance in the patientswith bullous pemphigus(BP).M ethods:Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in the glucocorticoid sensitivity group(40 patients)，glucocorticoid resistance group(48 patients)and 42 healthy controls.Themutations in polymorphic lociwere detected by SNaPshotSNP.Resu lts:Three kindsofgenotypes(CC，CG and GG)of BclIwere identified in the three groups，with no significantdifference among them(P＞0.05).Therewas no polymorphism of N363S，ER22/23EK and 9βin the three groups.Conclusion:The polymorphism of GR genemay not be correlated with the glucocorticoid resistance in the patientswith BP.

glucocorticoid receptor；gene polymorphism；bullous pemphigoid

1承德醫學院，河北承德，067000 2東平縣皮膚病防治所，山東東平，271500 3河北工程大學附屬醫院皮膚科，河北邯鄲，056002?通信作者