超聲波輔助 消化-石墨爐原子吸收法快速測定海參中總釩和有機釩含量

劉炎峻，徐 杰，周慶新，薛 勇，薛長湖*，王靜鳳

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

超聲波輔助 消化-石墨爐原子吸收法快速測定海參中總釩和有機釩含量

劉炎峻，徐 杰，周慶新，薛 勇，薛長湖*，王靜鳳

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

建立超聲波輔助消化-石墨爐原子吸收法快速測定海參中釩元素的方法。通過單因素試驗和正交試驗選擇適宜超聲波消化時間30 min與超聲波水浴溫度60 ℃，以及最佳的原子吸收條件（灰化溫度900 ℃、原子化溫度2 700 ℃、灰化時間20 s、原子化時間5 s），實現了海參樣品的快速消化，使金屬元素快速釋放，并成功應用到海參中釩含量的測定。方法加標回收率在94.2%～105.4%之間，檢出限為1.44×10－3μg/mL，符合測定要求。在選定的工作條件下測定，結果表明中國南北方產地的仿刺參總釩和有機釩含量分別為0.27～1.43 μg/g和0.22～1.08 μg/g，具有明顯的差異性，并且60.4%～85.7%的釩以有機釩形式存在。14 種海參的有機釩分析發現，糙海參有機釩含量最高，達2.56 μg/g。海參中的總釩及其有機釩含量受品種、采樣地點和環境的影響。超聲波輔助消化-原子吸收法測定海參中釩元素快速、穩定，具有較高的實用價值。

釩；海參；有機化程度；超聲波輔助消化-石墨爐原子吸收光譜法

釩是人體及其他動物必需的一種微量元素，具有多種生物學功能。1980年Schecher等[1]首先發現VO2＋有很好的類胰島素活性，使釩化合物開始作為一個潛在的藥物而受到關注[2]，同時近年來不斷證明無機釩鹽以及釩配合物均具有明顯的降血糖作用[3-4]。生物體中含量較少，但是幾乎所有動物體內都可以證實釩的存在，而海產品的含釩量最高[1]，尤其是大量食沉積物的底棲動物，如棘皮動物的海參類、海鞘類等[5]。

海參是棘皮動物門海參綱動物的統稱，海參綱約有900多個種類，全部生活在海洋中，世界上可以食用的海參有40 種左右，如海參屬（Holothuria）、刺參屬（Stichopus）等。海參高蛋白質，低脂肪，不含膽固醇，富含多種氨基酸、維生素和鋅、鐵、硒等人體普遍缺乏的多種微量元素[6]。劉小芳等[7]采用電感耦合-等離子體原子發射光譜（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）法分析表明，海參體壁釩含量3.51 mg/kg，而內臟中可達18.48 mg/kg，約為體壁釩含量的5 倍，經過對比海參所含有的釩，屬諸食品之首，海參內臟釩的含量極高，在治療糖尿病以及調節糖代謝和脂質代謝方面應有較好的研究價值。無機釩的生物活性低，而且難以吸收，因此具有物活性的有機釩是目前釩應用方面研究的熱點。

測定釩的方法主要有分光光度法[8]、電位滴定法[9]、石墨爐原子吸收（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）法[10]、ICP-AES法等[11]。GFAAS法具有靈敏度高、需要樣品量少、分析速度快、穩定性好等優點而被廣泛用于微量元素的測定中[12]。消化食品傳統的方法有干法灰化、濕法消化、高壓消解和微波消解法等[13]，幾種方法各有優劣，干法灰化前處理周期較長；濕法消化要用到大量硝酸、高氯酸等試劑；高壓消解所需時間較長，而微波消解需要有專門的較昂貴的設備支持；超聲波輔助消化（ultrasound-assisted digestion，UAD）的原理是當超聲波施加到分散在液體介質中的細粉狀固體時，超聲波產生的空化效應就會促進提取，溶解和消化過程[14]。空化氣泡在固-液界面塌陷的同時產生大量的能量并且釋放，造成沖擊波以及局部非常高的溫度和壓力，其導致的結果有：1）高壓提高了溶劑的滲透性和運輸；2）固體顆粒破碎，增大了與萃取劑的接觸面積，提高萃取劑的浸出金屬的能力[15]；3）促進氧化物質（如過氧化氫和羥自由基）的形成，協助有機物的氧化[16]。UAD的優點為條件溫和（接近室溫和大氣壓力下）、污染最小、試劑消耗低、消化時間極短[17-20]。由于海參含有較多復雜的有機和無機組分，并且干燥之后的海參樣品結構緊密，傳統的消解方式并不利于海參無機元素的釋放，因此引入UAD用于海參樣品釩的消化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集產自大連獐子島、煙臺蓬萊、山東青島、山東威海、遼寧盤錦、煙臺牟平、福建霞浦、浙江溫州的仿刺參干品各10 只（捕獲時間2013年11月），另購買分屬刺參科、海參科、瓜參科、蝶參科和尻參科的墨西哥等刺參、美國肉參、加州擬刺參、南非花刺參、梅花參、革皮氏海參、北極海參、糙海參、黃乳海參、白底輻肛參、圖紋白尼參、北大西洋瓜參、長尾蝶參、白肛海地瓜14 種海參干品。

釩單元素標準溶液（1 000 μg/mL） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；4-（2-吡啶偶氮）-間苯二酚、硝酸、高氯酸、過氧化氫（H2O2，30%）均為國產分析純；透析袋（3.5 kD） 美國Sigma-Aldrich公司；所有玻璃器皿浸泡在25%的硝酸溶液24 h以上，用去離子水漂洗3 次，并儲存在密封的容器中以避免污染。

1.2 儀器與設備

AA-6800F原子吸收分光光度計（配有GFA-EX7石墨爐原子化器、熱解涂層石墨管和ASK-6100自動采樣器）日本島津公司；釩元素空心陰極燈 北京曙光明電子照明儀器有限公司；KQ-600KDE臺式高功率數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HJ2雙頭加熱磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；ED36智能電熱消解爐 萊伯泰科有限公司；ALPHA 1-4 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；Unique-R20多功能超純水系統上海力申科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助消化條件

海參干粉（1.0 g）用15 mL硝酸-過氧化氫（4∶1，V/V）混合液浸漬于燒瓶中，密封后浸入超聲波水浴中，60 ℃條件下超聲處理30 min。冷卻至室溫后，4 000 r/min離心分離，將上清液轉移到消解管中。接著通過使用電熱消解爐80 ℃，10 min；100 ℃，10 min；160 ℃，10 min的加熱條件進行趕酸消化以去除溶液中的氮氧化物、氟化物以及酸類。消化液用加入了0.1 mol/L乙二胺四乙酸的1% HCl溶液定容至10 mL，最后進行原子吸收測定，同時做樣品空白溶液。

1.3.2 原子吸收條件

在整個加熱程序中（除了霧化階段），氬氣以1.0 L/min的恒定流量被通入。20 μL空白溶液、標準溶液、樣品空白和樣品溶液通過自動進樣器分別注入石墨管中并加熱。為研究最佳的原子吸收條件，以山東威海仿刺參干粉為待測樣品，取樣量1.0 g，加標量40 ng/mL，以加標回收率為指標，對灰化溫度、灰化時間、原子化溫度、原子化時間，進行四因素三水平的正交試驗。

1.3.3 方法驗證

1.3.3.1 標準工作曲線的繪制

在上述優化后已確定的最佳消化和檢測條件下，以1% HCl溶液為空白對照，利用釩單元素標準溶液（1 000 μg/mL）配制系列稀釋釩標準溶液（0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ng/mL），測定6 次其對應的吸光度，并對空白樣品進行11 次的重復測定，繪制標準曲線。

1.3.3.2 回收率實驗

為了驗證結果的準確度，將海參樣品分別加入不同量的標準品，進行加標回收實驗，采用UAD-GFAAS法測定釩含量，分析其回收率。

1.3.4 樣品處理

1.3.4.1 總釩樣品液制備

每個海參樣品設置6 個平行樣（n=6），測定數據為6 次測定的平均值。用超純水將海參體壁洗凈，冷凍干燥，并利用粉碎機粉碎成干粉，用UAD-GFAAS法進行消化并測定總釩的含量。

1.3.4.2 有機釩樣品液制備

參照Alzate等[21]的研究，將冷凍干燥，粉碎磨細后的海參體壁干粉（1.0 g）溶解于超純水中，并轉移到透析袋（截留分子質量3.5 kD），4 ℃條件下用超純水透析48 h，每12 h更換透析外液。將透析后的海參溶液冷凍干燥至質量恒定，采用UAD-GFAAS法測定有機釩的含量。

1.3.4.3 海參釩的有機化程度計算

1.4 統計分析

正交試驗的數據采用方差分析進行分析。正交試驗結果通過SPSS 13.0軟件進行數據分析，并計算K、k和R值。所有海參樣品重復進行消化和分析3 次取平均值，含量結果以±s（n = 3）的方式給出。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助消化條件的選擇

圖1 超聲波輔助消化時間的優化Fig.1 Optimization of ultrasound-assisted digestion time

為提高對樣品的消化能力，在實驗過程中加入硝酸與H2O2分別作為消化劑以及氧化劑[22]，硝酸-H2O2（4∶1，V/V）。以釩回收率為指標，利用單因素試驗優化超聲波浴的處理時間和水浴溫度，結果見圖1、2。UAD方法共需60 min。當超聲時間達到30 min時，水浴溫度達到60 ℃時，海參樣品中的釩提取完全。水浴溫度高達80 ℃時，會產生過多的泡沫，可能導致金屬元素的揮發或損失，因此選擇60 ℃作為合適的水浴溫度。

圖2 超聲波輔助消化水浴溫度的優化Fig.2 Optimization of ultrasound-assisted digestion temperature

2.2 原子吸收條件的正交試驗優化

GFAAS分析方法中，灰化溫度、灰化時間、原子化溫度和原子化時間等工作參數，通常是影響定量檢測最重要的因素[23]。采用L9（34）正交試驗對石墨爐原子吸收的最佳條件進行優化。以釩的回收率作為因變量，正交試驗的因素水平設計及結果見表1。

表1 正交試驗設計及結果Table1 Orthogonal array design and results

由表1可知，原子化溫度是影響釩定量測定的最重要因素，而影響釩定量檢測的4 個因素順序如下：C＞D＞A＞B。最適宜的石墨爐原子吸收工作條件A2B2C3D2即灰化溫度900 ℃、灰化時間20 s、原子化溫度2 800 ℃、原子化時間5s。然而，考慮到原子化溫度2 700 ℃和2 800 ℃之間的差距，為了降低石墨管的消耗，最佳的工作條件為A2B2C2D2，即灰化溫度900℃、灰化時間20 s、原子化溫度2 700 ℃、原子化時間5 s。GFAAS的最佳工作條件為燈電流10.0 mA、波長318.4 nm、狹縫寬度0.5 nm、積分時間0.5 s、進樣體積20 μL，控溫程序見表2。

表2 石墨爐原子吸收控溫工作條件Table2 Operating parameters of GFAAS

2.3 方法驗證

2.3.1 標準工作曲線與精密度

在上述GFAAS最佳工作條件下，通過依次測定系列標準溶液（0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ng/mL）的吸光度，從而得到標準工作曲線：A = 0.005 69x—0.001 42，R2= 0.999 7。從標準曲線可看出，在10～100 ng/mL的質量濃度范圍內，吸光度與釩質量濃度之間呈線性相關，相對標準偏差為0.94%～4.35%，具有較好的相關性與穩定性。

2.3.2 檢出限

經過對空白樣品11 次的重復測定，?b= 0.008 4，標準偏差Sb為0.000 43，最小測量AL=?b＋KSb。取K = 3時，檢出限為K × Sb/S = 1.44 × 10—3μg/mL；取K = 10時為定量限，定量限為K × Sb/S = 4.78 × 10—3μg/mL（Sb為空白標準偏差；S為工作曲線斜率）。

2.3.3 加標回收率

取海參樣品進行超聲波輔助消化并用GFAAS測定釩含量，對6 個樣品分別加標測定，結果見表3。加標回收率均在94.2%～105.4%之間，表明本法符合測試要求。

表3 樣品加標回收率結果Table3 Recoveries of vanadium from spiked samples

2.4 海參釩含量及其有機化程度分析

2.4.1 不同產地仿刺參的釩含量及其有機化程度分析

由于體壁是海參產品的主要可食部分，因此選取了中國不同產地冬季收獲的仿刺參，并利用UAD-GFAAS法對其體壁的釩含量進行了測定。8 種不同產地仿刺參中的總釩含量、有機釩含量及有機化程度見表4。從總釩含量和有機釩含量來看，南北方有較大的差異，分別在0.27～1.43、0.22～1.08 μg/g之間波動，產自北方的大連獐子島與煙臺蓬萊的仿刺參總釩含量最高，分別達到1.43 μg/g和1.32 μg/g，有機釩含量同樣最高，分別為1.08 μg/g和1.02 μg/g。與南方海域的仿刺參相比，北方海域的海參具有更高的釩含量，總釩量在0.91～1.43 μg/g之間，但差異不顯著。同時，各產地仿刺參有機化程度在60.4%～85.7%之間，產自浙江溫州的仿刺參有機化程度最高，達到85.7%，證明海參中釩主要以有機釩的形式存在。推測由于海參是一種底棲雜食性的海洋生物，主要以底質中的有機質、某些細菌和原生動物為食，海參在攝入無機態的釩后，大多數的釩會在體內進行生物轉化，轉化成有機形式。

表4 不同產地仿刺參的釩含量Table4 The contents of vanadium in sea cucumber Apostichopus opus japonicus icus from different regions ns

2.4.2 不同種類海參的有機釩含量分析

鑒于釩在海參中的主要存在形式是有機釩，因此對不同種類海參中的有機釩含量進行比較研究。墨西哥等刺參、美國肉參、加州擬刺參、南非花刺參、梅花參、革皮氏海參、北極海參、糙海參、黃乳海參、白底輻肛參、圖紋白尼參、北大西洋瓜參、長尾蝶參、白肛海地瓜14 種海參的有機釩含量結果如表5所示。

由表5可見，海參科比刺參科、瓜參科、蝶參科、尻參科具有更高的有機釩含量，在0.8～2.56 μg/g之間，其中糙海參與圖紋白尼參釩含量最高，分別達到2.56 μg/g和2.42 μg/g，而蝶參、梅花參、海地瓜有機釩含量最低，分別只有0.18、0.35、0.55 μg/g，海參大多生活在中緯度及低緯度海域，其中中緯度產海參中有機釩含量相比于低緯度海域產的海參要高，這可能由于中緯度海域氣候及海水水質的差異導致。Abdel-Moati[24]、Anan[25]等分別研究了約40 種來自卡塔爾和里海海域的魚類物種，闡明了釩含量具有類似的區域特點。從亞得里亞海海域不同采樣點收獲的貽貝，紫貽貝中也發現了釩含量的差異性（約0.5～7.5 μg/g）[26]。此后，Warnau等[27]發現，海參（Holothuria tubulosa）中的Ca、Fe等金屬濃度受到器官、季節、環境因素影響。

表5 不同種類海參的有機釩含量Table 5 The contents of vanadium in different species of Table 5 The contents of vanadium in different species of sea cucumbers bers

3 結 論

實驗研究了超聲波輔助實現了海參樣品的快速消化，過程簡便、快速、成本低，同時四因素三水平的正交試驗得到了最佳的石墨爐原子吸收工作條件。當超聲波水浴60 ℃條件下消化30 min，可以達到金屬元素的快速釋放，同時在石墨爐灰化溫度900 ℃、原子化溫度2 700 ℃、灰化時間20 s和原子化時間5 s條件下，檢出限為1.44×10－3μg/mL，并成功應用到海參中釩含量的測定。

分析8 種我國不同產地的仿刺參與14 種海參中釩含量的結果表明，海參中的釩含量受品種、采樣地點和環境的影響，并且海參中60.4%～85.7%的釩是以有機形式存在。產自中國南北8 個產地的仿刺參總釩、有機釩含量分別在0.27～1.43、0.22～1.08 μg/g之間，南北方具有明顯的差異性，同時海參中的釩主要以有機釩的形式存在。海參中的釩含量差異可能是由于周圍的采樣點的地質和水質特征或海參體內的累積機制差異導致。同時，由于海參中有機釩的存在，其存在形式、價態及降糖活性等值得深入研究。本實驗正在調查更大的樣本庫以正確表征影響釩的生物利用度和釩在海參中的積累機制的生物和環境因素，本研究為之提供了快速有效的定量方法。

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Determination of Vanadium in Sea Cucumbers by Ultrasound-Assisted Digestion-Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

LIU Yanjun, XU Jie, ZHOU Qingxin, XUE Yong, XUE Changhu*, WANG Jingfeng
(College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A fast method for vanadium determination by ultrasound-assisted digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry (UAD-GFAAS) was proposed. Using single factor and L9(34) orthogonal array designs, the best digestion conditions (30 min, 60 ℃) influencing and the best GFAAS conditions (ashing at 900 ℃ for 20 s, atomization at 2 700 ℃for 5 s) were achieved. The UAD-GFAAS method could provide complete mineralization of the samples for vanadium determination in sea cucumber with a detection limit of 1.44 × 10-3μg/mL and acceptable analytical recovery of 94.2%–105.4% for vanadium. Values of 0.27–1.43 μg/g in terms of total vanadium and 0.22–1.08 μg/g in terms of organic vanadium were obtained in sea cucumbers from different sampling sites, suggesting a significant difference between North and South coastal habitats of China. The highest vanadium content (2.56 μg/g) in Holothuria scabra was determined among fourteen species of edible sea cucumber. Total vanadium and organic vanadium contents showed significant differences among different species and different sampling sites of sea cucumbers. Moreover, most vanadium exists in an organic form. Therefore, ultrasound-assisted digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry is a rapid, accurate and stable method, which has a high practical value.

vanadium; sea cucumber; organic degree; ultrasound-assisted digestion and graphite furnace atomic absorption spectrometry

TS254.1

A

1002-6630（2015）04-0126-05

10.7506/spkx1002-6630-201504024

2014-05-30

國家海洋公益性科研項目（201105029）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31201329）；長江學者創新團隊發展計劃資助項目（IRT1188）

劉炎峻（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：fs-lauyang@hotmail.com

*通信作者：薛長湖（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產化學。E-mail：xuech@ouc.edu.cn