轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法的建立

劉 欣，張國叢，周興虎，祝長青，黃 明,*

（1.南京農業大學食品科技學院，南京肉制品加工產業創新中心，江蘇 南京 210095；2.石家莊市農林科學研究院，河北 石家莊 050041；3.南京佳邦食品有限公司，江蘇 南京 211225）

轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法的建立

劉 欣1，張國叢2，周興虎3，祝長青1，黃 明1,*

（1.南京農業大學食品科技學院，南京肉制品加工產業創新中心，江蘇 南京 210095；2.石家莊市農林科學研究院，河北 石家莊 050041；3.南京佳邦食品有限公司，江蘇 南京 211225）

為實現轉基因大豆MON89788的標識管理，針對轉基因大豆MON89788的品系特異性序列設計引物和TaqMan探針，建立轉基因大豆MON89788實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度和重復性進行檢測。結果顯示：建立的轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法能擴增出127 bp的產物，特異性強，靈敏度達到0.1%，約為40 個單倍體基因組拷貝，檢測重復性好，可成功應用于實際樣品檢測。因此，建立的轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法可以應用于轉基因大豆MON89788大豆及其制品的檢測。

轉基因大豆；MON89788品系；實時熒光PCR；品系特異性檢測；轉基因標識

自1996年轉基因作物開始商業化種植以來，每年都以驚人的速度發展，截至2012年全球轉基因作物種植面積達到1.703億 hm2，幾乎是1996年（170萬 hm2）的100 倍[1]。轉基因作物在解決全世界日益嚴重的糧食危機的同時，也帶來了食品安全和環境安全方面的諸多爭議[2]。為了防止轉基因生物可能存在的安全性問題，許多國家和地區制定了包括轉基因生物標簽制度在內的安全管理措施。我國于2001年發布了《農業轉基因生物安全管理條例》，明確規定了在中國境內銷售的農業轉基因生物應當有明顯的標識[3]。

標識管理制度的實施依賴于轉基因產品檢測技術，轉基因檢測技術包括蛋白質檢測技術和核酸檢測技術。近些年來，基于核酸的實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）因其高靈敏度、高特異性、無污染、可定量等優點，已成為主流的轉基因生物檢測方法。根據目標核酸的位置不同，PCR檢測策略可以分為4 種，即篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測和品系特異性PCR檢測[4]。與前3 種方法相比，品系特異性PCR是檢測外源插入載體與植物基因組的連接區DNA序列，具有非常高的特異性和準確性[5]，已經成為目前轉基因檢測方法研究的重點，至今已經有許多轉基因作物品系特異性檢測方法建立并應用，如轉基因大豆A2704-12和A5547-127[6]、轉基因大米KMD1[7]、轉基因玉米LY038[8]、轉基因油菜Topas 19/2[9]。

轉基因大豆MON89788品系是美國孟山都公司研發抗草甘膦大豆品種，已先后在美國、加拿大、日本和哥斯達黎加4 個國家商業化種植，并在菲律賓、澳大利亞、新西蘭、墨西哥等11 個國家和地區批準用于食品和飼料加工原料[10]。我國雖然不種植轉基因大豆，但是每年進口幾千萬噸轉基因大豆用于食品或飼料加工原料，轉基因大豆MON89788已于2011年批準進口我國用作加工原料[10]。本研究基于轉基因大豆MON89788品系特異性序列設計引物和探針，建立轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，以實現轉基因大豆MON89788的安全監管，滿足轉基因標識的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因大豆MON89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2，轉基因玉米MON810、T25、BT176、BT11，轉基因大米Bt63、KF6，轉基因油菜GT73、MS8，非轉基因大豆，質粒標準分子pMD19TMON89788以及相關檢測樣品（大豆顆粒、豆腐干、豆粕、豆奶粉） 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心。

植物基因組DNA提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit，目錄號：DP320-02） 北京Tiangen公司；TaqMan實時熒光定量PCR預混液FastStart Universal Probe Master（Rox，2×） 南京萊普泰生物科技有限公司；PCR引物與探針由上海輝睿生物技術有限公司合成。

1.2 儀器與設備

攪拌器 德國Vorwerk公司；雜交爐 德國GFL公司；J-E冷凍離心機 美國Beckman公司；Centrifuge 5417C微型離心機 德國Eppendorf公司；MB-102恒溫振蕩金屬浴 日本Bioer公司；C130-1230V手掌離心機 美國Labnet公司；NanoDrop 1000微量紫外分光光度計 美國Thermo公司；LightCycler 480 II實時熒光PCR擴增儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 制樣與DNA提取

固體樣品大豆顆粒、豆腐干、豆粕稱取約200 g樣品，在經徹底清洗的合適粉碎裝置中，將樣品均質為粉末顆粒大小約0.5 mm。粉碎器皿清洗的具體步驟為40 ℃含有清潔液的溫水中浸泡30 min，使用毛刷刷洗2 次，轉移至清水中使用干凈的毛刷刷洗4 次，用長流水沖洗10 min，吹風機吹干或者自然風干。

按照Tiangen試劑盒說明提取1～2 g樣品DNA，DNA純度應符合PCR檢測要求。

1.3.2 實時熒光檢測方法的建立及優化

根據GenBank上公布的轉基因大豆MON89788的基因序列（登錄號：FB572992.1），應用Primer Premier 5.0軟件，設計出轉基因大豆MON89788品系特異性引物和探針，使用熒光基團FAM作為探針的發光基團，擴增長度為127 bp。引物和探針見表1。

表1 轉基因MON89788實時熒光PCR檢測方法的引物、探針Table1 Primers and probe for real-time PCR

PCR反應體系為25 μL，包括2～5 μL DNA模板（50～200 ng），12.5 μL FastStart Universal Probe Master（Rox，2×），正、反向引物和探針，去離子水補齊體積。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；45個循環。對兩個引物和探針濃度進行優化，引物濃度優化梯度為400、300、200、150 nmol/L，相應探針濃度為引物濃度的一半，適宜的引物和探針濃度組合范圍根據Ct值、熒光強度和擴增曲線確定。

1.3.3 特異性檢測

以轉基因 大豆MON89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2，轉基因玉米MON810、T25、BT176、BT11，轉基因大米Bt63、KF6和轉基因油菜GT73、MS8的基因組DNA為模板，每個樣品DNA稀釋至50 ng/μL，加入2 μL DNA進行轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測，同時設置陰陽性及空白對照，陽性對照為質粒標準分子pMON89788，陰性對照為非轉基因大豆基因組DNA，空白對照為無菌水。

1.3.4 靈敏度檢測

將研磨好的純合MON89788品系大豆和非轉基因大豆干粉按照質量百分比進行混合，配制4個不同轉基因含量樣品，包括5%、1%、0.5%和0.1%。每個樣品DNA稀釋至10 ng/μL，加入5 μL DNA作為模板，進行轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測，每個樣品進行3次重復實驗，同時設置空白對照。

1.3.5 重復性檢測

將轉基因大豆MON89788的陽性樣品分為3 個標本，進行實時熒光PCR擴增，實驗分為3 次進行，每次設置3 個平行。通過計算3 個標本Ct值的標準差（s）和變異系數（coefficient of variation，CV）驗證實時熒光PCR檢測方法的重復性。

1.3.6 實際樣品檢測

應用建立的轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，對江蘇進口的申報為含有轉基因大豆MON89788的貨物以及出口或進行質控的大豆及其加工品進行轉基因大豆MON89788檢測。

2 結果與分析

2.1 樣品總DNA的提取

使用試劑盒法提取植物樣品總DNA，利用NanoDrop 1 000微量紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度，DNA的OD260nm/OD280nm接近1.8，初步判斷這些樣品DNA可以進行PCR檢測。

2.2 實時熒光PCR檢測方法的建立及條件優化

圖1 轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法引物與探針濃度優化Fig.1 Optimization of primer and probe concentrations for event-specific real-time PCR

不同的引物和探針終濃度配比結果如圖1所示，引物與探針終濃度為150、150、75 nmol/L，200、200、100 nmol/L，300、300、150 nmol/L，400、400、200 nmol/L時均得到良好的擴增曲線，熒光強度依次增強，對應的Ct值分別為30.69±0.14、28.82±0.11、27.19±0.03、25.14±0.14，Ct值間存在極顯著差異（P＜0.01），不同的引物和探針終濃度對實驗結果影響較大。在25 μL反應體系中，引物與探針終濃度為400、400、200 nmol/L時，即加入1 μL正、反向引物（10 nmol/L）和0.5 μL探針（10 nmol/L），可獲得較高的擴增效率，擴增曲線呈典型的S型曲線。

2.3 實時熒光PCR檢測方法的特異性

對轉基因大豆MON89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2，轉基因玉米MON810、T25、BT176、 BT11，轉基因大米Bt63、KF6，轉基因油菜GT73、MS8的基因組DNA進行擴增。如圖2所示，只有轉基因大豆MON89788基因組DNA與陽性對照成功擴增出轉基因大豆MON89788品系特異性序列，其他11 種DNA樣本及陰性對照、空白對照在45 個循環內沒有出現實時熒光擴增曲線。可見，針對轉基因大豆MON89788品系特異性序列的引物與探針特異性良好。

圖2 轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法特異性實驗結果Fig.2 The specificity of event-specific real-time PCR

2.4 實時熒光PCR檢測方法的靈敏度

圖3 轉基因大豆MON89788品系特異性實時熒光PCRR方法靈敏度實驗結果Fig.3 The limit of detection of event-specific real-time PCR

對不同的轉基因大豆MON89788含量的樣品提取DNA，進行實時熒光PCR擴增。如圖3所示，使用實時熒光PCR方法檢測50 ng DNA模板中轉基因含量為5%、1%、0.5%和0.1%的樣品時，存在明顯的擴增曲線，所得Ct值分別為29.65±0.11、32.11±0.06、33.20±0.06、35.57±0.20，Ct值均小于36。結果表明當轉基因含量為0.1%時擴增良好，即建立的轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法靈敏度可達0.1%，根據大豆基因組DNA大小[11]（1 115 Mbp）計算，相當于約40 個單倍體基因組拷貝，能滿足目前國際上的轉基因標識制度的需要[12]。

2.5 實時熒光PCR檢測方法的重復性

轉基因大豆MON89788的陽性樣品分為3 個標本，進行轉基因大豆MON89788品系特異性檢測，結果見表2，Ct值的標準差為0.12，CV為0.54% ，CV小于5%，在誤差允許范圍內。說明建立的轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法重復性好，檢測穩定性好。

表2 轉基因大豆MON89788品系特異性實時熒光PPCCRR方法重復性實驗結果Table2 Repeattability of event-specific real-time PCR

2.6 實時熒光PCR檢測方法的實際應用

應用上述建立的轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，對江蘇進口的70 批申報為含有轉基因大豆MON89788的貨物（大豆顆粒、豆粕）進行了檢測，所有樣品判斷為陽性的條件為Ct值小于36，Ct值大于36判斷結果為陰性，轉基因大豆MON89788檢測結果均為陽性，符合申報內容。同時對出口或進行質控的30 個大豆及其加工品（豆腐干、豆奶粉）進行轉基因大豆MON89788檢測，檢測結果均為陰性。

3 討論與結論

目前為止，已經有8 種轉基因大豆品系（GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、DP356043、DP305423、CV127、MON87701、MON87701×MON89788）被批準作為加工原料進入中國，各種與轉基因大豆相關的產品越來越多地進入市場，同時轉基因大豆及其制品的安全性問題也越來越受到人們的關注與討論。為了保障消費者的知情權和選擇權，建立準確、高效、快速的轉基因大豆檢測技術至關重要。

轉基因檢測技術可以分為蛋白質檢測技術和核酸檢測技術兩大類。蛋白質檢測技術主要包括蛋白質印跡法、酶聯免疫吸附法等，存在檢測成本高、所需時間長、蛋白質穩定性差等缺點，目前該類檢測技術在實際工作中較少涉及；核酸檢測技術主要包括PCR技術、分子雜交技術和基因芯片檢測技術等，由于檢測靈敏度高、特異性強、適用范圍廣、操作簡便等原因已廣泛地應用于各種轉基因食品的日常檢測中[13]。核酸檢測技術中的TaqMan實時熒光PCR技術實現了對整個PCR過程的實時監測，省去了常規PCR中電泳等后續處理，有效解決了核酸的交叉污染問題，此外在PCR反應體系中加入TaqMan探針，使得非特異性產物不能與探針雜交從而增加了檢測特異性，是目前應用廣泛的轉基因檢測技術[14]，已經成功應用于多種轉基因植物的檢測[15-17]。

在轉基因植物中，外源插入DNA片段一般包括啟動子、目的基因和終止子3 類元件，因此針對PCR擴增的目標序列的不同，其檢測特異性也有很大差別。品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入DNA與植物基因組DNA的連接區序列實現的，由于外源插入載體的插入位點是唯一的，并且連接區序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有很高的特異性，能夠區分具有相同構建的轉基因品系[4-5]。本研究基于轉基因大豆MON89788品系特異性序列建立了轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，靈敏度為0.1%，約為40個單倍體基因組拷貝，與歐盟研究中心的MON89788檢測方法[18]相比更加靈敏，能夠滿足轉基因檢測需要，同時引物擴增片段長度短（127 bp），也適用于加工產品的檢測。另外該方法和Kim[19]、李飛武[20]等建立的品系特異性常規PCR方法相比，檢測靈敏度相近，操作簡便，省去了PCR后續的電泳步驟，避免了對人體有害的染色劑溴化乙錠等的使用，減少了造成污染和假陽性的機會。

本研究建立的用于轉基因大豆MON89788品系特異性檢測的TaqMan實時熒光PCR方法特異性強、靈敏度高，可以應用于轉基因大豆MON89788及其制品的檢測，以滿足轉基因大豆MON89788的標識需要，值得推廣和使用。

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Establishment of Event-Specific Real-Time PCR Method for Detection of Genetically Modified Soybean MON89788

LIU Xin1, ZHANG Guocong2, ZHOU Xinghu3, ZHU Changqing1, HUANG Ming1,*
(1. Nanjing Innovation Center of Meat Products Processing, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Shijiazhuang Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050041, China; 3. Nanjing Jiabang Food Co. Ltd., Nanjing 211225, China)

For implementation of labeling regulations, an event-specific real-time PCR method for the detection of genetically modified soybean MON89788 was established in this study. Primers and TaqMan probe were designed based on the event-specific sequence of MON89788 soybean. The specificity, sensitivity and repeatability of the developed method were examined, respectively. The results showed that the method could amplify a 127 bp product specifically; the limit of detection was 0.1% in 50 ng of soybean genomic DNA, approximately corresponding to 40 soybean haploid genome copies; and this method had good repeatability and could be successfully applied to the detection of real samples. These results indicated that the strain-specific real-time PCR method was suitable for the identification of genetically modified soybean MON89788 and its products.

genetically modified soybean; MON89788 event; real-time PCR; event-specific detection; transgenic labeling

S565.1

A

1002-6630（2015）04-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201504038

2014-03-12

公益性行業（農業）科研專項（201303083-2）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2014304）；南京市生物農業項目（2013）

劉欣（1989—），女，碩士研究生，主要從事肉品加工與質量控制研究。E-mail：liuxin_ld@sina.com

*通信作者：黃明（1970—），男，教授，博士，主要從事肉品加工與質量控制研究。E-mail：mhuang@njau.edu.cn