毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光分離檢測(cè)辣椒粉中羅丹明B

屈忠凱，鄧光輝*，王士偉，王 輝，方夢(mèng)霞，韋福賽，劉清鴻

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光分離檢測(cè)辣椒粉中羅丹明B

屈忠凱，鄧光輝*，王士偉，王 輝，方夢(mèng)霞，韋福賽，劉清鴻

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

建立一種以三聯(lián)吡啶釕（Ru(bpy)32＋）為發(fā)光體系的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于分離和測(cè)定辣椒粉中的羅丹明B含量。考察檢測(cè)電壓、Ru(bpy)32＋溶液濃度、磷酸鹽緩沖液的pH值和濃度、分離電壓、進(jìn)樣電壓與進(jìn)樣時(shí)間等因素對(duì)分離檢測(cè)的影響。結(jié)果表明：在檢測(cè)電壓1.14 V、Ru(bpy)32＋溶液濃度5 mmol/L、磷酸鹽緩沖溶液濃度20 mmol/L（pH 8.0）、進(jìn)樣時(shí)間10 s、進(jìn)樣電壓10 kV、分離電壓15 kV條件下，羅丹明B在6 min中得到分離。方法的線性范圍為5×10—7～5×10—5mol/L，檢出限為1×10—7mol/L（RSN=3）。對(duì)1.0×10—5mol/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定5 次，遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%和1.5%。該方法可成功應(yīng)用于辣椒粉中羅丹明B含量的測(cè)定。

毛細(xì)管電泳；電化學(xué)發(fā)光；辣椒粉；羅丹明B

羅丹明B，又稱(chēng)玫瑰紅B，是一種鮮桃紅色的人工合成的染料，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，常被用作工業(yè) 染色劑、熒光試劑[1-2]和實(shí)驗(yàn)分析指示劑[3]，屬于非食品原料。實(shí)驗(yàn)證明羅丹明B會(huì)致癌，可引起誘變或致畸[4-5]。中國(guó)衛(wèi)生部已經(jīng)將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》，日本以及歐美等國(guó)家和地區(qū)均已禁止在食品及食品相關(guān)產(chǎn)品中使用[6]。

由于羅丹明B價(jià)格低廉、色澤鮮艷、穩(wěn)定性強(qiáng)特點(diǎn)[7]，不法商販為了牟取暴利，違法使用羅丹明B染料對(duì)辣椒以及辣椒制品進(jìn)行染色，以假亂真，欺騙消費(fèi)者，危害消費(fèi)者的身體健康。因此，對(duì)辣椒中羅丹明B的檢測(cè)顯得十分重要。目前對(duì)于羅丹明B的分析方法主要有液相色譜法[8-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]、高效液相色譜熒光檢測(cè)法[16-19]、薄層色譜法[20]和分光光度法[21-22]等。而我國(guó)目前尚無(wú)檢測(cè)食品中羅丹明B的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，2010年實(shí)施的SN/T 2430—2010《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》[23]中需要使用凝膠色譜，費(fèi)用昂貴，并且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程工作量大，液相色譜法前處理復(fù)雜，分光光度法選擇性差，質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，普及程度不高。因此為了有效控制其在食品中的濫用，需要建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度檢測(cè)羅丹明B的方法。毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法與上述方法相比具有進(jìn)樣量少、選擇性高、靈敏度高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[24-25]，本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法對(duì)辣椒粉中的羅丹明B含量進(jìn)行測(cè)定，方法靈敏度和準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、簡(jiǎn)便、快速，為合理評(píng)價(jià)辣椒粉質(zhì)量提供了一種可靠的分析方法。

圖1 羅丹明B的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of rhodamine B

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（含量99.5%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；辣椒粉 南寧沃爾瑪超市；三聯(lián)吡啶釕六水合氯化物（Ru(bpy)3Cl2?6H2O，含量99%） 美國(guó)Alfa Aesar公司；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；二次蒸餾水實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

MPI-A型毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（配有電化學(xué)檢測(cè)池、0.05 μm Al2O3粉末、專(zhuān)用鉑盤(pán)檢測(cè)電極（300 μm i.d）、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對(duì)電極組成的三電極系統(tǒng)） 西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司；0.45 μm聚醚砜濾膜 上海嘉措儀器設(shè)備有限公司；未涂層石英毛細(xì)管（50 μm×50 cm） 河北永年光導(dǎo)纖維廠；TP-214電子分析天平 丹佛分析儀器公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；1810-B型自動(dòng)雙重水蒸餾器 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條件

未涂層石英毛細(xì)管（350 μm×50 cm，50 μm）每次使用前用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗毛細(xì)管5 min，二次蒸餾水沖洗5 min，運(yùn)行緩沖液沖洗10 min。溶液進(jìn)入毛細(xì)管前需用0.45 μm聚醚砜濾膜過(guò)濾。鉑檢測(cè)電極使用前需用0.05 μm Al2O3粉末進(jìn)行拋光處理，置于水中超聲波清洗干凈，清洗后用光學(xué)顯微鏡觀察使其與毛細(xì)管對(duì)接，對(duì)接距離在（100±20） μm。電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在檢測(cè)池中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)池中充滿5 mmol/L Ru(bpy和80 mmol/L 磷酸鹽（phosphate buffered saline，PBS）溶液（pH 8.0）共350 μL，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每運(yùn)行3次更換新鮮溶液，并取出工作電極，用0.05 μm Al2O3粉末重新拋光，以保證實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。運(yùn)行緩沖液為20 mmol/L PBS溶液（pH 8.0）。毛細(xì)管分離電壓15 kV、進(jìn)樣電壓10 kV、進(jìn)樣時(shí)間10 s、光電倍增管高壓800 V。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備和樣品的提取及制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用乙醇定容為50 mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用時(shí)適當(dāng)稀釋。

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥辣椒粉末 （過(guò)65 目）約2 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入75%乙醇溶液20 mL，超聲處理（功率100 W、頻率50 kHz）30 min，冷卻，取上清液至離心管中，10 000 r/min離心10 min，樣品用0.45 μm聚醚砜濾膜過(guò)濾，待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅丹明B與吡啶釕發(fā)光體系的電化學(xué)發(fā)光行為

圖2 羅丹明B循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammogram of rhodamine B

以20 mmol/L磷酸鹽PBS溶液（pH 8.0）配制5 mmol/L Ru(bpy)溶液，在0.40～1.30 V范圍內(nèi)采用循環(huán)伏安法掃描，掃速為0.05 V/s，工作電極為鉑電極，測(cè)試羅丹明B對(duì)Ru(bpy化學(xué)發(fā)光的影響。實(shí)驗(yàn)顯示羅丹明B溶液在堿性條件微弱的電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光強(qiáng)度為100～200。當(dāng)Ru(bpy溶液加入羅丹明B后，電化學(xué)氧化峰有增強(qiáng)現(xiàn)象（圖2），電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比未加時(shí)增強(qiáng)了4 倍（圖3），表明羅丹明B與Ru(bpy)32＋發(fā)生共發(fā)光反應(yīng)，故可以通過(guò)測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度的變化用于羅丹明B定量分析。

圖3 羅丹明B電化學(xué)發(fā)光圖Fig.3 Electrochemiluminescence of rhodamine B

2.2 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)電壓的影響

檢測(cè)電壓是影響發(fā)光強(qiáng)度的一個(gè)重要因素。電泳實(shí)驗(yàn)條件為分離電壓15 kV，羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液電動(dòng)進(jìn)樣10 s（進(jìn)樣電壓10 kV），固定其他參數(shù)不變，考察1.10～1.20 V范圍對(duì)羅丹明B發(fā)光強(qiáng)度的影響。1.10～1.14 V范圍內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度隨著檢測(cè)電壓增大而增大，當(dāng)檢測(cè)電壓為1.14 V時(shí)發(fā)光強(qiáng)度最高，超過(guò)1.14 V，發(fā)光強(qiáng)度反而減少，故選擇1.14 V為優(yōu)化的檢測(cè)電壓。

2.3 運(yùn)行緩沖液濃度與pH值的影響

圖4 運(yùn)行緩沖液濃度（A）和pH值（B）對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of concentration and pH of running buffer on ECL intensity

固定PBS緩沖液的pH 8.0，考察PBS的濃度在10～35 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。由圖4可見(jiàn)，PBS緩沖液的濃度在20 mmol/L時(shí)發(fā)光強(qiáng)度最大，因此選擇20 mmol/L作為最佳濃度。固定PBS緩沖液濃度為20 mmol/L，考察其pH 6.8～8.8范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)得知，pH 6.8～8.0范圍內(nèi)時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著pH值增大而增大。pH 8.0時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最大，pH值大于8.0時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度反而減小，因此選擇8.0作為最佳pH值。

2.5 分離電壓、進(jìn)樣電壓與進(jìn)樣時(shí)間的影響

分離電壓主要影響遷移時(shí)間，電壓越高，遷移時(shí)間越短。實(shí)驗(yàn)主要考察分離電壓在8～18 kV內(nèi)對(duì)樣品遷移時(shí)間和分離的影響。綜合考慮峰寬、靈敏度、噪音、焦耳熱及分析時(shí)間等因素，選擇15 kV作為分離電壓。

羅丹明B進(jìn)樣方式采用電動(dòng)進(jìn)樣，在進(jìn)樣電壓為10 kV的條件下，考察不同進(jìn)樣時(shí)間對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度、遷移時(shí)間和峰寬等的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，峰變寬，遷移時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)10 s后，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度峰高度無(wú)明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選擇峰面積進(jìn)行定量，峰展寬會(huì)使測(cè)量誤差增大，綜合考慮，因此選擇進(jìn)樣時(shí)間為10 s。

固定進(jìn)樣時(shí)間為10 s，在6～14 kV范圍內(nèi)考察進(jìn)樣電壓對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度影響。實(shí)驗(yàn)得知，進(jìn)樣電壓在6～10 kV時(shí)， 電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著進(jìn)樣電壓增大而增大。在10～14 kV時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著進(jìn)樣電壓增大反而減小，而且峰形變差。所以，選擇10 kV作為進(jìn)樣電壓。

2.6 線性范圍、檢出限與精密度

配制一系列濃度的羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣3 次，計(jì)算峰面積的平均值。以濃度（μmol/L）為橫坐標(biāo)x，對(duì)應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)作圖，得到線性回歸方程、 線性范圍和檢出限見(jiàn)表1。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table1 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges and Table 1 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges and detection limits mits

在最優(yōu)條件下對(duì)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣5 次，得到羅丹明B的遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%和1.5%，說(shuō)明方法的精密度良好。羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液毛細(xì)管電泳圖見(jiàn)圖5。

圖5 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法圖Fig.5 CE-ECL electropherogram of rhodamine B

2.7 樣品分析

圖6 辣椒粉樣品（a）和辣椒粉樣品加標(biāo)羅丹明B（bb）的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法圖Fig.6 CE-ECL electropherograms of (a) blank chili power and (b) chili power spiked with 120 μg of rhodamine B

辣椒粉樣品電泳圖見(jiàn)圖6a，本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)辣椒粉中含有羅丹明B，樣品加標(biāo)圖見(jiàn)圖6b，樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。電泳條件為分離電壓15 kV、進(jìn)樣電壓10 kV、進(jìn)樣時(shí)間10 s、運(yùn)行緩沖液濃度20 mmol/L、pH 8.0、檢測(cè)電壓1.14 V、Ru(bpy)32＋溶液濃度5 mmol/L。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)（n==33）Table2 Results of recovery tests (n == 33))

3 結(jié) 論

由于羅丹明B具有叔胺官能團(tuán)，對(duì)Ru(bpy)32＋的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)有增敏作用，因此可以利用Ru(bpy)32＋電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)電壓1.14 V、Ru(bpy)32＋溶液濃度5 mmol/L、PBS緩沖溶液濃度20 mmol/L （pH 8.0）條件下，建立了羅丹明B的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)法，并將其應(yīng)用于辣椒粉中羅丹明B含量分析，其檢出限低于液相色譜法和分光光度法。此法具有操作簡(jiǎn)單、所需試劑量少、檢測(cè)快速、專(zhuān)屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

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Separation and Determination of Rhodamine B in Chili Power by Capillary Electrophoresis with Electrochemiluminescence Detection

QU Zhongkai, DENG Guanghui*, WANG Shiwei, WANG Hui, FANG Mengxia, WEI Fusai, LIU Qinghong
(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Chemical and Biological Transformation Process Technology, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nannin g 530006, China)

A sensitive and simple method based on capillary electrophoresis (CE) with electrochemiluminescence (ECL) detection has been developed for the separation and determination of rhodamine B in chili power. The effects of detection potential, the concentration of Ru(bpy)32+, the acidity and concentration of the running buffer, separation voltage and injection time were investigated to acquire the optimum conditions. The detection electrode was a 300 μm diameter platinum microelectrode at a detection potential of 1.14 V (versus Ag/AgCl). Rhodamine B could be well separated within 6 min in a 50 cm length fused-silica capillary at a separation voltage of 15 kV in a 20 mmol/L PBS buffer (pH 8.0). The response range of rhodamine B was from 5 × 10-7to 5 × 10-5mol/L with a detection limit of 1 × 10-7mol/L (RSN= 3). The proposed method demonstrated long-term stability and reproducibility with relative standard deviations (RSD) of less than 3.5% for both migration time and electrophoretic peak area (n = 5). This method can be successfully applied t o the analysis of rhodamine B in chili power with satisfactory assay results.

capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; chili power; rhodamine B

O657.8

A

1002-6630（2015）04-0217-04

10.7506/spkx1002-6630-201504043

2014-05-07

廣西高校人才小高地建設(shè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助計(jì)劃項(xiàng)目（桂教人[2011]47號(hào)12）

屈忠凱（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯V與毛細(xì)管電泳。E-mail：qzk1016@163.com

*通信作者：鄧光輝（1957—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代分離分析技術(shù)。E-mail：dgh321@163.com